The site has been moved


It is here now

 

 

Г. Б. Смирнов

Механизмы приобретения и потери генетической информации бактериальными геномами

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, 123098 Москва, ул. Гамалеи, 18.

e-mail: smirngb@orc.ru 

(Успехи современной биологии, 2007)

См. также:

«Случай благоприятствует подготовленному геному»

Линн Капорале [29]

 

Аннотация

Приобретение и потеря генетического материала являются существенными событиями в эволюции геномов. Равновесие между этими процессами соблюдается не всегда. В результате происходит экспансия одних геномов и сокращение других. До последнего времени считалось, что редукции подвергаются геномы бактерий, которым свойственен только паразитический или симбиотический стиль существования. Сейчас очевидно, что редукция геномов имеет место не только у патогенных бактерий и эндосимбионтов, но и у свободноживущих непатогенных бактерий.

Естественный отбор представляется сомнительной причиной редукции микробных геномов, поскольку бактерии близкородственных видов, существовавшие в тех же (или очень похожих) условиях не редуцировали свои геномы. В некоторых случаях имело место даже приобретение генетического материала. Таким образом, паразитическое или эндосимбиотическое существование не может считаться основной причиной редукции геномов.

Выдвигается концепция, согласно которой наследование новой последовательности ДНК зависит от нуклеотидной последовательности в сайте-мишени реципиентного генома. Это означает, что предметом отбора является не фенотипический признак, кодируемый донорной ДНК, а новая последовательность ДНК, независимо от её кодирующей способности. Этот тип отбора обозначен как полинуклеотидный (Пн)-выбор. Для наследования новых нуклеотидных последовательностей Пн-отбор является необходимым и достаточным. Однако для потери участков ДНК требуется как Пн- выбор, так и естественный отбор.

Предлагается гипотеза, согласно которой редукция геномов является фазой двунаправленного процесса «пульсации геномов». Предполагается, что после компактизации генома может происходить приобретение генетического материала, приводящее к образованию новых генетических сочетаний. Пульсация генома имеет эволюционный смысл только для очень быстро размножающихся организмов.

 

Известно, что изменения генетического материала могут происходить как под влиянием внешних факторов, так и в силу внутренних причин. В данной работе будут обсуждаться биологические факторы, способствующие изменению наследственной информации, и не будут рассматриваться абиотические внешние факторы, индуцирующие изменчивость.

Очевидно, что эволюция генов и эволюция геномов — процессы различные. Предметом данной работы является эволюция бактериальных геномов. При этом основное внимание будет уделено не наследованию и распространению признаков в крупных популяциях, а механизмам первичных процессов приобретения и потери генетического материала индивидуальными геномами.

Согласно современным представлениям первичные эволюционно значимые генетические изменения у бактерий могут быть следующими: 1) мелкие изменения в ДНК за счёт спонтанных или индуцированных точковых мутаций, 2) различные рекомбинационные события, или ошибки репликации (slippage), часто связанные с повторяющимися и мигрирующими генетическими элементами; эти события ведут к внутригеномным перестройкам: транслокациям, делециям, инверсиям и дупликациям, 3) перемещения генетического материала между геномами (приобретение генетического материала), включающие обмен генетической информацией между видами и родами, т.е. горизонтальный перенос, 4) утрата частей генома, называемая редукцией или компактизацией генома. [см. 16, 21].

I. Потеря и приобретение генетического материала.

Направленность эволюции и размер генома (экспансия или компактизация) зависят от соотношения процессов потери и приобретения генетического материала. В случае преобладания процесса потери генетического материала над процессом его приобретения наблюдается уменьшение размера генома, которое часто называют редуктивной эволюцией.

I.1. Примеры редукции геномов.

До последнего времени считалось, что наиболее яркие примеры редуктивной эволюции связаны с патогенными микроорганизмами или эндосимбионтами [68, 8, 54, 109].

Ниже представлены наиболее демонстративные примеры редуктивной эволюции. В этих примерах приведены данные о микроорганизмах, претерпевших утрату генов и обладающих редуцированными геномами, и их ближайших родственниках, которых этот процесс миновал.

Одним из отличий возбудителя чумы Yersinia pestis от возбудителей кишечных иерсиниозов Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica является утрата первым функций определённых генов. При сравнении нуклеотидных последовательностей Y. pseudotuberculosis и Y. pestis установлено, что за время после отщепления от общего (с Y. pseudotuberculosis) предшественника возбудитель чумы Y. pestis приобрёл 32 гена, но утратил функции более 460 генов. На настоящий момент в геноме Y. pestis не работает (делетированные плюс мутантные) около 13% генов, которые функционируют в Y. pseudotuberculosis. При этом за счет инактивации (не утраты генетического материала, а превращения в псевдоген) потеряна функция 208 генов Y.pestis. За период с момента дивергенции в геноме Y. pseudotuberculosis произошло только 8 транспозиционных событий, закреплённых отбором. В то же время, в геноме Y. pestis имела место настоящая экспансия мигрирующих генетических элементов (МГЭ), принадлежащих каждому из присутствующих в геноме семейств МГЭ. Сейчас геном Y. pseudotuberculosis содержит 20 IS-элементов, тогда как геном Y. pestis около 130 [31]. (Табл. 1).

Таким образом, в ходе непродолжительной эволюции Y. pestis наблюдались события трёх видов: а) утрата функций ряда генов при сохранении их генетического материала, б) потеря самих генов (значительно преобладающая над приобретением за счёт горизонтального переноса) и в) активное распространение мигрирующих элементов.

Оценивая объём эволюционных событий, произошедших со времени дивергенции Y.pseudotuberculosis и Y.pestis, не следует забывать, что эта дивергенция началась очень недавно (2000-15000 лет) и всё произошло по меткому выражению Брендана Рена «пока эволюция моргнула»[117].

У возбудителя проказы Mycobacterium leprae, также как и в случае возбудителя чумы, при формировании современного генома имели место редукционные события двух типов: утраты функции генов за счёт их превращения в псевдогены и полной потери определённых сегментов генетического материала, в состав которых входят кодирующие гены. Сравнение проводили с ближайшим генетическим родственником — возбудителем туберкулёза Mycobacterium tuberculosis. Согласно расчёту, возбудитель проказы в ходе редуктивной эволюции потерял около 2000 генов. [34]. (Табл. 1, Рис. 1а,б).

Рис. 1 a. Размеры геномов Micobacterium leprae и Micobacterium tuberculosis (полный круг — геном Micobacterium tuberculosis, голубой сектор — геном Micobacterium leprae, вишнёвый сектор — разница между геномами).

Рис. 1 б. Белок кодирующие гены Micobacterium leprae и Micobacterium tuberculosis (полный круг — гены Micobacterium tuberculosis, голубой сектор — геном Micobacterium leprae, желтый сектор — разница между геномами).

 

Таблица 1. Размеры и свойства геномов родственных бактерий

 

 

 

 

 

 

Вид

Геном(н.п.)

Число генов

Белок-кодир. гены

псевдогены

% кодир. посл.

B. pertussis

 

 

 

 

 

Tohama I

4 086 189

3 867

3 436

358

82

B. parapertussis 12822

4 733 551

4 467

4 185

217

86

B. bronchiseptica

 

 

 

 

 

RB 50

5 339 179

5 072

4 994

12

91

M. leprae TN

3 268 203

2 770

1 605

1 115

49

M. tuberculosis

 

 

 

 

 

H 37 Rv

4 411 532

4 048

3 989

8

90

B. quintana

 

 

 

 

 

Toulouse

1 581 384

1 356

1 142

165

72

B. henselae

 

 

 

 

 

Houston-1

1 931 047

1 665

1 488

124

72

Y. pestis

 

 

 

 

 

KIM

4 600 755

4 240

4 086

54

82

Y. pestis biovar

 

 

 

 

 

medievalis

4 595 065

4 138

3 895

141

81

Y. pseudotuberculosis

4 744 671

4 095

3 901

73

82

B. mallei ATCC 23344

 

 

 

 

 

chr.1

3 510 148

3 394

2 996

346

79

chr.2

2 325 379

2 115

2 029

69

81

B. pseudomallei K96243

 

 

 

 

 

chr.1

4 074 542

3 529

3 399

61

83

chr.2

3 173 005

2 406

2 329

65

81

B. thailandesis E264

 

 

 

 

 

chr.1

3 809 201

3 343

3 276

4

86

chr.2

2 914 771

2 371

2 358

3

86

 

Утрата значительной части генома в ходе редуктивной эволюции зарегистрирована у возбудителя коклюша Bordetella pertussis [76] Этот возбудитель поражает только людей. Его ближайшими родственниками являются Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica. B. parapertussis вызывает заболевание, аналогичное коклюшу, у людей и овец, а B. bronchiseptica часто выделяется от свиней и других млекопитающих и редко от людей.

Сиквенирование геномов представителей этих видов бордетелл показало, что геном B. pertussis существенно меньше (4 086 186 н.п. против 5 338 400 н.п.) генома B. bronchiseptica и содержит на несколько сотен кодирующих генов меньше (Табл. 1). Геном B. pertussis содержит 261 инсерционных элемента, среди которых IS481, IS1002 и IS1663, отсутствующие у B. bronchiseptica, причём IS481 представлен в количестве 238 копий [76, 38].

Нечто похожее наблюдается и у бартонелл. Геном Bartonella quintana, которая поражает только людей, вызывая у них траншейную лихорадку, состоит из 1 581 384 н.п. и содержит 1142 гена, кодирующих белки, тогда как геном ближайшего родственника — Bartonella henselae, вызывающей болезнь кошачьих царапин, состоит из 1 931 047 н.п. и содержит 1488 белок кодирующих генов (Табл. 1). Геном B. henselae содержит 301 уникальный ген (по сравнению с B. quintana), тогда как геном B. quintana — только 26 уникальных генов.

Ещё более интересен пример редуктивной эволюции у представителей рода Burkholderia. Сейчас сиквенированы геномы представителей трёх родственных видов: Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei и Burkholderia thailandensis. B. mallei — возбудитель сапа, B. pseudomallei — возбудитель мелиоидоза, а B. thailandensis — непатогенный сапрофит, обитающий в почве. Данные сравнительной геномики показали, что геномы бактерий этих трёх видов высоко гомологичны, однако, в геномах B. mallei и B. thailandensis отсутствует значительное количество фрагментов, присутствующих в геноме B. pseudomallei. Соответственно, и общее количество генов, и количество генов, кодирующих белки, больше в геноме B. pseudomallei по сравнению с геномами B. mallei и B. thailandensis (Табл.1, Рис.2 а,б). [73, 55].

Рис. 2 а. Размеры геномов Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei (полный круг — геном Burkholderia pseudomallei, голубой сектор — геном Burkholderia mallei, вишнёвый сектор — разница между геномами).

Рис. 2 б. Белок кодирующие гены Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei (полный круг — геном Burkholderia pseudomallei, голубой сектор — геном Burkholderia mallei, вишнёвый сектор — разница между геномами).

 

При этом, в отличие от B. pseudomallei и B. thailandensis, B. mallei содержит в своём геноме большое количество IS-элементов (171 копия), за счёт которых можно отнести перемещение и утрату генов. Аналогичная закономерность наблюдается в случаях Y.pestis и B.pertussis, геномы которых содержат существенно больше мигрирующих элементов, чем их менее вирулентные близкие родственники [31, 76]. Это противоречит утверждению [66], согласно которому мобиильные элементы, повторы и вызываемые ими геномные перестройки более характерны для свободноживущих микроорганизмов.

Приведенные примеры далеко не исчерпывают весь ассортимент редукции геномов у возбудителей инфекционных болезней. Редуцированными являются геномы Chlamidia trachomatis (1,04 м.н.п.), Treponema pallidum (1,14 м.н.п.), Rickettsia prowachekii (1,1 м.н.п.) [84]. При этом важно отметить, что процесс редукции у различных возбудителей происходил на протяжении разного времени и, соответственно, привёл к последствиям разного масштаба.

Утрата частей генома, наблюдаемая у возбудителей инфекций, имеет место и у эндосимбионтов. К настоящему времени накопилось достаточно примеров облигатного мутуализма между эндосимбионтами и их хозяевами. Наиболее изученными являются бактерии Buchnera aphidicola -эндосимбионт тлей, Wigglesworthia glossinidia и Sodalis glossinidius — эндосимбионты мухи це-це Glossina brevipalpis, Carsonella ruddii — эндосимбионт азиатской цитрусовой псилиды Diaphorina citri (насекомое, похожее на маленькую цикаду), Sitophilus ozyrae (SOPE) — эндосимбионт долгоносиков, Blattobacterium — эндосимбионт тараканов, Blochmannia — эндосимбионт муравьёв семейств Formicineae и Camponotus. [см. 111, 84].

Вследствие инфекции предшественником Escherichia coli растительных тлей, произошедшей сотни миллионов лет назад, возник новый вид — эндосимбионт B. aphidicola. К настоящему времени геном B. aphidicola утратил большую часть исходного генетического материала (сравнение с E. coli). Показано, что существуют штаммы B. aphidicola, (выделенные из афид Cinara cedri), геном которых составляет 450 т.н.п., что даже меньше генома Mycoplasma genitalium [45].

Другой эндосимбионт Wigglesworthia glossinidia brevipalpis также происходит от энтеробактерии, многие миллионы лет назад поселившейся в клетках мухи це-це — переносчика возбудителя сонной болезни Trypanosoma brucei. Современный геном W. glossinidia состоит из одной хромосомы размером 697.724 н.п., которая содержит 611 белок кодирующих генов, и одной плазмиды pWig1 размером 5.200 н.п. В хромосоме сохранены гены биосинтеза витаминов и другие метаболические гены, необходимые для жизни и размножения мухи. Удивительно, что у W. glossinidia сохранились некоторые гены, необходимые для свободного образа жизни, например, гены жгутиков. Необычна утрата этим геномом гена dnaA [8]. Однако на настоящий момент обладателем рекордно малого генома является Carsonella ruddii — эндосимбионт псилиды Diaphorina citri. Геном этой бактерии состоит всего из 159 662 н.п. и содержит только 182 белок-кодирующих генов [71].

Таким образом, мы наблюдаем потерю генетического материала у возбудителей инфекционных болезней и эндосимбионтов и отсутствие этого явления (во всяком случае, в таких масштабах) у близкородственных штаммов.

I.2. Общепринятое объяснение редукции геномов.

Практически все исследователи, изучающие феномен редукции геномов, объясняют его тем, что штаммы с уменьшенными геномами утратили значительную часть генетической информации «за ненадобностью» т.е. в связи с тем, что с переходом к паразитическому существованию в значительной части функций отпала необходимость. Соответственно, признаки, кодируемые этими генами, не стали поддерживаться естественным отбором и гены, их кодирующие, были утрачены [8, 54, 12, 10, 11, 70, 33, 65, 69, 97, 68]. Эта общепринятая концепция представляется мне не совсем корректной.

I.3. Факты, которые трудно объяснить с помощью общепринятой концепции.

Простая концепция утраты генов за ненадобностью не объясняет реальной картины происходящего и, соответственно, оставляет ряд вопросов открытыми.

1. Близкие родственники микроорганизмов, претерпевших редукцию генома, свои геномы не уменьшали, хотя являлись и являются патогенными паразитами (B. henselae, M. tuberculosis, B. pseudomallei, B. bronchiseptica). Геномы некоторых из этих бактерий даже приобретали генетический материал за счёт горизонтального переноса [88, 59, 44, 37].

Существует попытка объяснить различные направления эволюции геномов (потеря против приобретения генов) у близкородственных патогенных бактерий тем, что утрачивающие генетический материал бактерии являются «специалистами», т.е. существуют в одном организме (например, человека), тогда как их родственники, не претерпевающие редукцию геномов, являются «генералистами», т.е. способны инфицировать различных хозяев [9]. В качестве «специалистов» приводятся B. quintana, Rickettsia prowazekii и B. pertussis, а «генералистов» — их ближайшие родственники B. henselae, Rickettsia conorii и B. bronchiseptica, соответственно. Подразумевается, что геномы «генералистов» не теряют генетический материал, который поддерживается естественным отбором, т.к. нужен для осуществления возможности инфицировать более широкий круг хозяев.

Но, во-первых, возбудитель R. prowazekii, обозначенный как «специалист», был обнаружен в родственниках белки — летягах [24], а во-вторых, геномы «генералистов» тоже теряют гены. Это показано и для B. bronchiseptica и для B. henselae [76, 9]. Например, в штаммах B. bronchiseptica комплекса IV, выделеных от людей, отсутствовали или были сильно изменены за счет дивергенции более 230 генов по сравнению со штаммами комплекса I, выделенных от животных, то есть наблюдалась компактизация генома, что ранее относили только к штаммам B. pertussis и B. parapertussis, выделенных от человека [76]. Важно, что в 8 из 13 изученных штаммов B. bronchiseptica комплекса IV был утрачен ген dnt, кодирующий внутриклеточный дермонекротический токсин Dnt, который активирует малую GTP-азу Rho. Предполагается, что Dnt, в конечном счёте, необходим для колонизации B. bronchiseptica верхних дыхательных путей поросят [27], хотя наиболее вероятно, что его роль в патогенезе не зависит от того, какой хозяин инфицирован бордетеллами. Наряду с частой потерей гена dnt, у штаммов B. bronchiseptica комплекса IV наблюдали высокий процент утраты гена коклюшного токсина рtx, который, как и ген dnt, всегда присутствует в штаммах B. pertussis. То есть, в этих случаях мы не наблюдаем даже намёка на то, что штаммы B. bronchiseptica комплекса IV теряют участки генома, адаптируясь к новой экологической нише (человеческому организму), и повторяя путь, пройденный B. pertussis. Иными словами, наблюдаемая утрата генов у штаммов B. bronchiseptica комплекса IV не носит адаптивного (к организму человека) характера.

Таким образом, очевидно, что утрата частей генома имеет место не только у «специалистов», но и у «генералистов», и что компактизацию геномов последних вряд ли можно объяснить повторением пути «специалиста» или адаптацией к новой экологической нише.

2. Оказалось, что редукция генома наблюдается не только у паразитов и эндосимбионтов, но и у свободноживущих микроорганизмов. Речь идёт о Prochlorococcus marinus, морской одноклеточной цианобактерии, численно доминирующей в фитопланктоне тропических океанов. Адаптированные к высокой степени освещённости организмы (HL) имеют самый маленький геном из известных у автотрофов (1 657 990 н.п., 1,716 генов). Редукция генома у HL штаммов привела к резкому снижению содержания в ДНК G+C и утрате репаративных генов, ответственных за корректирующую функцию [41, 85]. Судя по всему, это первый документированный случай компактизации геномов у свободноживущих микроорганизмов [41, 85, 42, 51].

Также показателен пример редуктивной эволюции у представителей рода Burkholderia. Редуктивный характер изменений генома показан не только для высокопатогенного B. mallei, но и для свободноживущего сапарофита B. thailandensis. При этом характер делеций у B. mallei и B. thailandensis различен. Эти данные означают, что в ходе эволюции от общего предшественника, близкого к B. pseudomallei, геном B. thailandensis утрачивал ДНК, не будучи паразитом. Поскольку и паразит — B. mallei, и сапрофит — B. thailandensis движутся по пути компактизации геномов, за счёт различий в условиях их существования можно пытаться отнести только тип делеций, но не направление эволюции геномов этих бактерий [73, 55].

Таким образом, наблюдается редукция геномов не паразитических микроорганизмов B. thailandensis и P. marinus.

Следовательно, учитывая редукцию геномов свободноживущих непатогенных бактерий, паразитизм или эндосимбиотизм не могут считаться единственной и главной причиной редуктивной эволюции.

3. Почему-то подразумевается, что гены, не поддерживаемые естественным отбором, должны утрачиваться. Нам не известны экспериментальные доказательства приобретения селективного преимущества за счёт утраты нейтральной генетической информации. Есть доказательства противоположного: отсутствия селективных преимуществ в результате потери генетического материала [98]. Кроме того, существует огромное количество данных о сохранении в геномах не кодирующей ДНК или генов, не оказывающих влияние на фенотип, включая повторы различного типа, IS-элементы, псевдогены и т.п. Короткие повторяющиеся последовательности в различном количестве копий сохранились даже в редуцированном до минимума геноме M. genitalium [104], а псевдогены и не кодирующие повторы (хотя и в очень незначительном количестве) обнаружены в одном из самых маленьких из известных на настоящий момент геноме Nanoarchaeum equitans — единственного паразита среди архей и единственного представителя нового царства наноархей [109]. Участки геномов, занятые повторами различного типа, IS-элементами, псевдогенами никак не могут сохраняться под влиянием естественного отбора в его классическом понимании, но не утрачиваются.

4. И, наконец, потеря того или иного гена в огромном большинстве случаев присходит не как таковая, а в составе фрагмента ДНК, включающего утрачиваемый ген. Более того, этот процесс часто многоступенчатый: сначала ген инактивируется за счёт мутации, а затем псевдоген утрачивается в составе более крупного фрагмента ДНК за счёт делеции [10, 97]. То есть, правильнее было бы говорить не о том, что ген стал не нужен в создавшихся условиях (например, паразитизма), а фрагмент ДНК, содержащий уже псевдоген и, возможно, другие гены, стал почему-то не нужен. Получается, что в этой ситуации естественный отбор не способствует сохранению некого фрагмента ДНК, не кодирующего ранее существовавший признак. На что же ориентирован естественный отбор, удаляющий фенотипически не значимый псевдоген? Учитывая экспериментальный факт отсутствия селективных преимуществ в результате потери генетического материала [98], это не понятно и не укладывается в простую картину утраты гена «за ненадобностью».

Если отвлечься от бактерий, то можно отметить, что противоположно направленные процессы редукции и экспансии геномов происходят и у одноклеточных эукариотов [63], и у растений, и у насекомых, которые не являются ни эндосимбионтами, ни патогенными паразитами [см. 49, 20, 79, 80]. Масштабы этого явления гораздо большие, чем у бактерий. В результате процессов редукции и экспансии различия в общем количестве ДНК в клетках растений разных видов достигли 1000 раз, а у эукариотических организмов отличия доходят до 200 000 раз [56].

Следовательно, концепция редукции бактериальных геномов в связи с утратой значительной части генетической информации «за ненадобностью», как не поддерживаемой естественным отбором, вряд ли вообще что-то объясняет.

II. Молекулярные механизмы потери и приобретения генетического материала

II.1. Нуклеотидные последовательности в точках рекомбинации при интеграциях и делециях.

При изучении эволюции микроорганизмов нет возможности исследовать промежуточные формы, — ископаемых остатков геномов не существует. В распоряжении исследователей имеются только современные геномы, которые, однако, содержат определённую информацию о происходивших событиях. Как интеграция привнесённого сегмента ДНК в резидентный геном, так и делеция участка генома — события, которые оставляют «молекулярный след». Таким «следом» являются новые нуклеотидные последовательности, образующиеся в точках рекомбинационного взаимодействия (recombination joints). Анализируя такие «следы» можно сделать вывод о природе взаимодействий, приведших к рекомбинации, за счёт которой в геном попал новый участок ДНК или из генома был удалён какой либо сегмент ДНК. Возможность анализировать «молекулярные следы» рекомбинационных событий появилась совсем недавно благодаря достижениям сравнительной геномики, после того как были полностью сиквенированы геномы многих микроорганизмов, их родственников и делеционных мутантов. Было установлено, что по краям вновь интегрированного сегмента ДНК могут находиться а) IS-элементы, б) гены тРНК (с одной стороны) и гены интеграз (с другой), в) повторяющиеся последовательности, которые входят в состав сайта интеграции интегрона, г) ДНК профагов.

В точках рекомбинационного взаимодействия, на месте делетированнного материала обнаруживаются IS-элементы (МГЭ) или повторяющиеся последовательности.

Следовательно, внедрения генетического материала и делеции обусловлены наличием в геномах перечисленных последовательностей, являющихся сайтами предпочтительной рекомбинации.

II.2. Сайты интеграции (tРНК, интегроны, IS-элементы, короткие повторы).

Почему рекомбинация в этих сайтах предпочтительна?

Одним из доминирующих механизмов внедрения нового генетического материала (например, геномных островов, островов патогенности) в ДНК-мишень является интеграция в сайты, находящиеся в генах тРНК и тмРНК. Гены тРНК имеют три сайта интеграции, два из которых симметричны, а один — нет. Интегразы, связывающиеся с этими сайтами, строго специфичны, т.е. взаимодействуют либо с симметричными, либо с несимметричными сайтами [82, 115].

В эти сайты могут интегрировать геномные острова, плазмиды, геномы умеренных бактериофагов. Существует много примеров использования генов тРНК в качестве сайтов интеграции, но в данном контексте в качестве фрагментов интегрировавших по этому механизму, можно привести геномные острова B. henselae и уникальные участки генома B. quintana. 62% генетического материала B. henselae, отсутствующего у B. quintana, входит в состав 4 сегментов генома, 3 из которых являются геномными островами, а 4-й — профагом. Каждый из островов B. henselae фланкирован с одной стороны генами лейциновой тРНК, а сдругой — генами интеграз. На месте этих островов и профага в геноме B. quintana находятся некодирующие остатки генома профага. Дополнительный небольшой уникальный для B. henselae участок генома содержит последовательность, сходную с островом патогенности Photorabdus luminescens. (Photorabdus luminescens является симбионтом нематод, которые инфицируют насекомых — вредителей растений; нематоды отрыгивают бактерий, которые, продуцируя токсин, убивают насекомых). Участки генома, уникальные для B. quintana, содержат ген, гомологичный гену эффектора YopP иерсиний и ген секреторного белка для гемолитического токсина азотфиксирующей почвенной бактерии Sinorhizobium meliloti. Оба этих гена сцеплены с генами тРНК [9].

Анализ сиквенированных геномов показывает, что локализация генов тРНК имеет определённую специфичность. Так, у энтеробактерий эти гены относительно равномерно распределены по всему геному, тогда как у бацилл они сгруппированы в блоки и расположены в первой трети генома. Соответственно, районы интеграции генетического материала в гены тРНК у бактерий разных таксономических групп будут отличаться.

Интегроны представляют собой сложные генетические элементы, предназначенные для захвата генов и содержащие ген интегразы, сайт интеграции для привносимых фрагментов ДНК и промотор для экспрессии генов (Рис.3). Сайт интеграции содержит инвертированные повторы, которые узнаются интегразой. Особенно интересно то, что интегроны очень древние генетические элементы, и хотя чаще всего они захватывают кассеты с генами антибиотикоустойчивости, сами интегроны сформировались задолго до эры применения антибиотиков [см. 91-93] Кроме генов антибиотикоустойчивости [64, 90] кассеты, захватываемые интегронами и суперинтегронами, могут содержать гены, кодирующие факторы патогенности [106, 74], гены метаболизма [19, 91], или гены, кодирующие рестрикционные ферменты [91, 103]. Различные геннные кассеты содержат интеграционные сайты (attC), которые не гомологичны друг другу. В большинстве исследованных случаев интегроны бактерий различных видов, даже принадлежащих одному роду, содержат разные генные кассеты. Локализация интегронов (например, в геномах бактерий рода Vibrio) может быть различной, но очевидно наличие предпочтительных сайтов [92]. Перечисленные данные с очевидностью указывают на предетерминированность захвата генетического материала в определённые специализированные сайты (платформы интегронов) за счёт сложного и древнего механизма сайт-специфической рекомбинации.

Рис. 3. Структура (А) и работа (Б) интегрона.

 

 

Интеграция многих МГЭ зависит от наличия в сайте-мишени повторяющихся последовательностей. Так, например, предпочтительной мишенью (сайтом узнавания и связывания) для транспозаз в геномах микроорганизмов различных видов оказались внегенные повторяющиеся палиндромы REP [101]. Однако в большинстве случаев специфичность интеграции хотя и зависит от нуклеотидной последовательности мишени, но не является строгой [62]. Итак, МГЭ могут интегрировать в сайты, образованные повторами, из которых состоят также сайты интеграции в генах тРНК и в интегронах. Остаётся выяснить, как распределяются в геномах сами повторы.

II.3. Распределение IS-элементов и повторяющихся последовательностей в геномах.

Существует ли специфика в присутствии повторов и IS-элементов в ДНК различных бактерий и их распределении по геному? Повторы и IS-элементы могут служить сайтами интеграции и, не находясь в структуре интегрона. Эти же элементы служат горячими точками рекомбинации при образовании делеций.

Например, в геноме M. leprae присутствует очень мало IS-элементов, но большое количество повторов трёх типов RLEP, REPLEР и LEPREP. Участки генома M. leprae, гомологичные геному M. tuberculosis, распределены по геному M. leprae в ином порядке, нежели в M. tuberculosis. Отличия в расположении этих участков и мозаичность генома M. leprae в целом, по-видимому, связаны с наличием по флангам сегментов, гомологичных с M. tuberculosis, указанных диспергированных повторов и генов тРНК, которые вызвали разнообразные геномные перестройки [34].

Обычно прямые повторы стимулируют делеции, дупликации и транслокации, а инвертированные повторы — инверсии [99, 89, 87]. В качестве прямых повторов, генерирующих делеции и другие перестройки, могут выступать IS-элементы (Рис.4). Недавно это получило очередное подтверждение на уровне целого генома B. pertussis [26]. IS-элементы присутствуют в каждой идентифицированной точке «стыковки» сегментов генома после рекомбинации. То же наблюдалось при анализе делеций B. mallei и структуры гомологичных (синтеничных) участков в геномах B. mallei и B. pseudomallei. Было установлено, что в точках стыковки участков синтении находятся IS-элементы, которые также фланкировали 2 синтеничных участка хромосомы 1 B. pseudomallei, присутствующие в хромосоме 2 B.mallei [73]. Делеция 102 т.н.п. локуса pgm Y.pestis происходит с высокой частотой (10-4 и выше) за счёт рекомбинации между двумя копиями фланкирующих элементов IS100 [43].

Рис. 4. Геномные перестройки, стимулируемые IS-элементами. А. Внедрение IS-элемента в геном; Б. Распространение IS-элемента в геноме за счет  транспозиции; В. Реципрокные транслокации; Г. Делеции и образование плазмид.

 

Таким образом, вероятность, размер и локализация геномных перестроек зависят от распределения в геномах повторяющихся последовательностей (включая IS-элементы). Установлено, что не только локализация, но и само присутствие IS-элементов в геномах не случайно. Так, отмечена специфика в присутствии IS-элементов в геномах бордетелл. Элемент IS1663 обнаружен в геномах штаммов B. bronchiseptica комплекса IV и в штаммах B. pertussis, но отсутствует у других бордетелл. Элемент IS481 обнаружен у всех штаммов B. pertussis и у двух штаммов B. bronchiseptica, выделенных от лошадей, но не у других штаммов. Элемент IS1002 найден у всех штаммов B. pertussis и у штаммов B. parapertussis человеческого происхождения [38]. То же отмечается для других IS-элементов и других видов бактерий (Табл.2). При сравнении различных штаммов микоплазм было показано, что тип повторов их количество и локализация в геноме определяет вероятность и характер геномных перестроек данного генома (Табл.3,4) [86].

Таблица 2.   IS элементы в бактериях различных родов


 

Род

IS1

IS3

IS4

IS5

IS6

IS21

IS30

IS66

IS91

IS110

IS256

IS605

IS630

IS982

IS1380

ISAs1

ISL3

NCYa

NDa

Total


 

Agrobacterium

 

3

 

3

 

 

 

8

 

 

 

 

2

 

 

 

 

 

1

17

Bacillus

 

2

11

 

4

4

 

 

 

 

 

 

1

2

 

 

 

 

 

24

Bordetella

 

5

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1

 

 

6

Brucella

 

 

 

2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2

Burkholderia

 

2

 

1

 

1

 

 

 

 

5

 

1

 

 

 

 

 

6

16

Campylobacter

 

 

 

 

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1

Clostridium

 

1

1

 

 

 

1

 

 

 

1

1

 

 

 

 

 

 

 

5

Corynebacterium

 

1

 

 

 

 

 

 

 

 

2

 

 

 

 

 

3

 

 

6

Coxiella

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3

Enterococcus

 

 

 

 

4

 

2

 

 

 

1

 

 

 

 

 

2

 

 

9

Erwinia

 

1

 

 

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2

Escherichia

10

13

6

5

 

 

3

 

5

 

 

4

 

 

 

7

 

 

1

54

Haemophilus

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6

 

6

Halobacterium

 

 

11

3

 

 

 

 

 

 

 

1

 

 

 

 

 

2

2

19

Helicobacter

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1

 

 

 

 

 

 

 

1

Lactobacillus

 

3

 

2

 

 

 

 

 

 

1

 

 

1

 

 

1

 

 

8

Lactococcus

 

5

 

 

15

 

 

 

 

 

2

 

 

4

 

 

 

 

 

26

Leptospira

 

2

 

 

 

 

 

 

 

2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4

Moraxella

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2

Mycobacterium

 

5

1

1

1

2

 

 

 

4

9

 

 

 

 

 

1

1

 

25

Mycoplasma

 

14

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

14

Neisseria

 

1

 

2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1

 

4

Nocardia

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1

 

 

1

Proteus

 

 

 

 

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1

2

Pseudomonas

 

3

 

4

 

5

 

 

1

1

 

 

2

 

 

 

2

5

3

26

Rhizobium

 

5

 

2

2

1

 

4

 

 

3

 

2

 

 

 

 

 

1

20

Salmonella

 

 

2

 

5

 

 

 

 

 

 

5

 

 

 

1

 

 

 

13

Serratia

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1

 

 

 

 

1

Shigella

4

5

 

1

 

1

 

 

 

 

 

 

1

 

 

 

 

 

 

12

Staphylococcus

 

 

 

 

8

 

 

 

 

 

1

 

 

 

 

 

1

2

 

12

Streptococcus

 

2

 

5

 

 

3

 

 

 

1

1

 

 

 

 

5

1

 

18

Streptomyces

 

1

 

4

1

 

 

 

 

3

 

 

 

 

 

 

 

 

1

10

Vibrio

 

 

 

13

 

 

 

 

 

 

 

1

 

 

 

1

 

 

 

15

Yersinia

 

2

 

 

 

4

 

 

 

1

1

1

 

 

 

 

 

 

 

9


 

Таблица 3.   Повторы различных классов в геномах Mycoplasma

Вид микоплазм

SSR


 

CR


 

DR


 

IR


 

D/I


 

Mycoplasma pulmonis

18

29

 653

 68

 6.5

Ureaplasma urealyticum

10

 8

  72

 10

17.8

Mycoplasma genitalium

14

11

 645

 19

57.2

Mycoplasma pneumoniae


 6

 

36

 

2476

 

303

 

 9.3

 

 

SSR- простые повторы; CR – близкие повторы; DR – прямые повторы; IR – инвертированные повторы.

D/I – отношение суммарных длин прямых и  инвертированных повторов.

(Из:  E. P. C Rocha. and A. Blanchard, 2002)
 

Табл. 4. Встречаемость  смежных совершенных малых повторов (SSR) в геномах M. genitalium и M. pneumoniae

Длина повтора

Позиция повтора

Последовательность

повтора

Количество единиц

M. genitalium

 

 

 

  3

86051-86066

CTT

5

  3

169475-169523

TAG

16

  3

224534-224555

TAG

7

  3

227130-227163

TAG

11

  3

349735-349750

TCT

5

  3

351452-351482

TAG

10

  3

425824-425857

TGT

11

  3

429308-429335

TAG

9

  3

429967-423015

CTT

16

  5

212939-212954

CAAAA

3

  6

384465-384489

TATTAC

4

M. pneumoniae

 

 

 

  2

60190-60210

AG/AC

5/5

  2

65147-65169

CT

11

  3

23651-23669

TAG

6

  6

34932-34950

AACCCC

3

  6

775707-775725

AACCCC

3

 

Перечисленные данные говорят о том, что вероятность геномных перестроек, включая транспозиции МГЭ, зависит от наличия в геноме: самих МГЭ, генерирующих перестройки, сайтов интеграции МГЭ, часто представленных повторами, и повторов, количество которых зависит от вида микроорганизма, размера и нуклеотидного состава генома.

Таким образом, распределение IS-элементов и повторов в геномах бактерий разных видов не одинаково, не беспорядочно и специфично. Так как повторы являются горячими точками рекомбинационных событий, то характер и частоты геномных перестроек должны определяться особенностями распределения повторов и быть видоспецифичными [15].

II.4. Образование повторов.

Как возникают повторы, каковы их основные свойства и что определяет их распределение по геномам?

Геномы бактерий содержат преимущественно короткие тандемные повторы, такие как семейство"variable number of tandem repeats» (VNTR) и семейство «short sequence repeats» (SSR). Они могут образовываться как в результате рекомбинации, так и ошибок репликации при редактировании (slipped strand mispairing) или репарации [см. 104]. Установлено, что близко расположенные прямые повторы (close direct repeats — СDR) находятся в избытке по сравнению с повторами другимх типов во всех геномах. В наибольшей степени это характерно для одного из самых маленьких геномов M.genitalium. (Табл.4). Вцелом, динамика образования повторов в бактериальной ДНК выглядит следующим образом: короткие повторы служат праймерами для образования тандемных дупликаций (повторов), которые в свою очередь преобразуются в разбросанные (по геному) повторы [7] (Рис.5). Увеличение расстояния между повторами приводит к их стабилизации и достигается за счёт транспозиций (внедрения между повторами) и других геномных перестроек. Частота делеций частей повтора прямо пропорциональна размеру повторяющихся последовательностей и обратно пропорциональна длине спейсера, поэтому, чем длиннее повторы, тем больше должно быть расстояние между ними, чтобы обеспечить их стабильность [32, 61, 22, 78]. Перечисленные данные свидетельствуют о том, что размер, ориентация и взаимное расположение повторов определяет судьбу участков ДНК, находящихся между ними, или прилежащих к ним. Кроме того, перечисленные свойства повторов определяют вероятность внедрения в сайт, содержащий повторы, любых фрагментов ДНК, от IS-элементов до геномных островов.

Рис. 5. Динамика тандемных повторов: экспансия и редукция.

 

 

II.5. Молекулярные события, приводящие к геномным перестройкам.

Таким образом, наиболее вероятная последовательность эволюционно важных событий в геномах представляется следующим образом. Сначала за счёт ошибок (проскальзывания) репликации возникают близко расположенные короткие тандемные повторы, которые могут дуплицироваться и за счёт геномных перестроек распространяются по геному. Уже эти повторы могут генерировать делеции. Повторы могут служить сайтами интеграции для IS-элементов. IS-элементы и другие МГЭ также являются горячими точками для рекомбинаций, приводящих к делециям (прямая ориентация) или другим геномным перестройкам: инсерциям и инверсиям (инвертированные повторы). Инвертированные повторы составляют основу специализированных сайтов интеграции в составе интегронов и генов тРНК, куда внедряются генные кассеты и геномные острова из других геномов. Все перечисленные генетические элементы распределены в геномах неслучайно и в той или иной степени видоспецифично. Соответственно неслучайными и видоспецифичными являются геномные перестройки, стимулируемые повторами и различными МГЭ. Таким образом, структура генома направляет его эволюционное развитие. К таким же выводам о роли структуры генома в его эволюции пришла Линн Хелена Капорале [см. 29, 30].

III. Полинуклеотидный (Пн) выбор

Представленные данные свидетельствуют о том, что характер геномных перестроек, т.е. потеря или приобретение генетического материала, транслокации или инверсии сегментов ДНК зависит от наличия, размера, ориентации, типа и локализации в геноме повторяющихся элементов ДНК. То есть, события генетической изменчивости неслучайны по типу, локализации в геноме и вероятности. Это означает, что программа изменений геномов определяется структурой самих геномов.

Гены, а во многих случаях сегменты ДНК, содержащие (или не содержащие) гены (МГЭ, геномные острова), интегрируют в геном в случае присутствия в нём адекватной области (сайта) интеграции. Следовательно, последовательность нуклеотидов ДНК-мишени является одним из компонентов материала некого внутреннего отбора для наследования или не наследования новой генетической информации. Это первый этап приобретения генетической информации, и он необходим как для включения в геном фрагмента ДНК, поступившего извне (горизонтальный перенос), так и для интеграции резидентного фрагмента ДНК в новый сайт внутри генома или в другой геном той же клетки.

Стабильность интегрированного сегмента ДНК в геноме определяется свойствами фланкирующих его нуклеотидных последовательностей. То есть, если фланкирующие последовательности не благоприятствуют эксцизии (например, отсутствуют протяжённые прямые повторы), то интегрированный фрагмент стабилен. При этом сегмент ДНК может быть стабильным (или нестабильным) совершенно независимо от присутствия в нём экспрессирующегося гена, влияющего на фенотип, и, соответственно, независимо от условий внешней среды в её классическом понимании. Это означает, что утрата генетического материала запрограммирована особенностями строения геномов, а не определена особенностями внешней среды, в которой находится носитель генома. Верно и другое: носитель генома находится в тех или иных условиях, потому что они соответствуют его возможностям, сформировавшимся после акта редукции.

Однако как уже было отмечено, фактор отбора работает и в этой системе, но он не связан со свойствами организма (бактериальной клетки), а связан со свойствами наследуемого сегмента ДНК, внешней средой для которого является нуклеотидная последовательность-мишень. Одним из первых эту мысль в общей форме сформулировал Ричард Докинс в книге «Эгоистический ген» [36, стр. 47], а позже другие авторы развили её применительно к мигрирующим генетическим элементам, и другим ДНК, не кодирующим селективных признаков (эгоистическая ДНК) [75, 40].

Нужно сказать, что ещё раньше идею о направленном характере изменений ДНК, изменений в рамках некой внутренней программы высказали наш соотечественник Л.С. Берг и Р. Гольдшмит. Берг ещё в 1922 году в труде «Номогенез, или эволюция на основе закономерностей» писал; «Замечательно, что организм обладает способностью активно приспосабливаться к среде, обнаруживая при этом как бы присутствие некоего внутреннего регулирующего принципа, а с другой стороны — развитие идет, нередко вопреки внешним условиям, в определенном направлении в силу внутренних конституционных причин, связанных с химическим строением протоплазмы» [2, 1, с. 135]. Те же идеи высказывал Р.Гольдшмит; «...зародышевая плазма ...регулирует процесс развития в соответствии с постоянной программой.» [47]. Ещё более определённо высказывались Д.Н. Соболев и Ю.А. Филипченко. В книге «Начала исторической биогенетики, Киев, 1924» Соболев пишет: «...в понятие эволюции следует вкладывать определённое содержание, именно под этим именем нужно понимать развитие начал, заложенных в самом развивающемся существе, развёртывание определённого плана, предначертанного природой...» [цит. по 6]. О том же говорит Филипченко: «...при эволюции играли главную роль какие-то внутренние силы, заложенные в самих организмах,...в чём именно состояли эти силы, каково их происхождение...на этот счёт нам ничего не известно...» [6].

Таким образом, отечественные эволюционисты — Берг, Гольдшмт, Филипченко, Соболев, Любищев [3], которые считали, что ведущим фактором эволюции является некая программа, заложенная в самом эволюционирующем организме, более, чем на пол-столетия опередили основоположников идеи эгоистической ДНК. Перечисленные отечественные учёные не могли знать ничего о содержании эволюционной программы, почти ничего не знаем об этом и мы, но данные геномики позволили нам представить себе, каковы молекулярные механизмы, используемые этой программой.

Одна из задач данной работы — показать, что большинство актов внедрения в геном фрагментов генетического материала (из другого генома или из другого сайта этого же генома), независимо от наличия или отсутствия в привносимом материале фенотипически значимого гена (ов), происходит в строгой зависимости от реципиентной нуклеотидной последовательности. Выбор нового сегмента ДНК, подлежащего внедрению в геном или удалению из генома, под влиянием свойств ДНК-мишени принципиально отличается от классического естественного отбора тем, что объектом его действия является не фенотипический признак, а последовательность нуклеотидов.

Этот выбор приобретаемого геномом фрагмента ДНК под влиянием свойств ДНК-мишени, обеспечиваемый рекомбиназой, можно назвать полинуклеотидным (Пн)-выбором. Предлагаемый термин должен облегчить дистанцирование от классического термина «естественный отбор». Пн-выбор — это выбор полинуклеотидов под влиянием полинуклеотидного контекста. Пн-выбор — тоже естественный процесс, который представляет собой этап, предшествующий классическому дарвиновскому отбору. Поэтому мне представляется целесообразным считать естественный отбор состоящим из двух этапов: 1) полинуклеотидного выбора и 2) фенотипического (дарвиновского) отбора.

Пн-выбор не имеет отношения к внешней среде в её традиционном понимании и действует на любой фрагмент донорного генетического материала, независимо от характера информации, которую этот материал содержит (или не содержит).

Компонентами Пн-выбора являются:

1. наследуемый (или удаляемый из генома) полинуклеотидный фрагмент,

2. полинуклеотидная последовательность-мишень или сайт интеграции (делеции),

3. фермент(ы), осуществляющий рекомбинационный акт.

Основные изменения ДНК-мишени, то есть изменения «среды обитания» для вновь наследуемой ДНК происходят, в основном, за счёт транслокаций, делеций, инверсий и самих интеграций. Как уже упоминалось раньше, эти события, приводящие к формированию новых нуклеотидных последовательностей, не зависят от какого-либо селективного давления внешней среды. То есть, в рамках концепции Пн-выбора «внешняя среда» для наследуемой и сохраняемой новой генетической информации формируется без участия внешней среды в обычном понимании.

Рассмотрим пример сложной перестройки, приводящей к созданию новой нуклеотидной последовательности и, как следствие, нового адаптивного признака. При голодании в стационарной фазе большая часть популяции E.coli гибнет, тогда как выживают мутанты GASP (от growth advantage in stationary phase). Существует несколько классов таких мутаций. Один из них представлен мутациями sgaA. Это двухэтапная перестройка, названная IN(cstA::IS5-IS5D), в которой участвуют элементы IS5. В хромосоме дикого типа на расстоянии 60 т.н.п. от гена cstA находится неактивный оперон ybeJ-gltJKL-ybeK, перед которым расположен элемент IS5D. Ген cstA и оперон ybeJ-gltJKL-ybeK транскрибируются в противоположных направлениях. На первом этапе происходит внедрение нового IS5 между промотером и CRP сайтом гена cstA. Внедренный IS5 оказывается в инвертированой позиции по отношению к резидентному. На втором этапе происходит инверсия фрагмента между двумя IS5 за счёт рекомбинации между ними (Рис.6). Инверсия активирует ранее неактивный оперон ybeJ-gltJKL-ybeK за счёт подстановки к нему CRP-связывающего сайта гена cstA. CRP активирует ins5A промотер p5l [58], связываясь с CRP сайтом. Одновременно с этим инактивируется ген cstA. В этом не было бы ничего особенно замечательного, если бы в момент инактивации исходно активного гена он не обеспечивал бы бактериям селективного преимущества. Ген cstA кодирует олигопептид-пермеазу, индуцируемую голоданием и, обеспечивая возможность утилизации олигопептидов [96], способствует выживанию в стационарной фазе, так как позволяет голодающим бактериям утилизировать олигопептиды погибших [120].

Рис. 6. Схема двухэтапной перестройки, приводящей к возникновению селективного преимущества. (См. пояснения в тексте)

 

 

Такая перестройка интересна тем, что она инактивирует ген, дающий бактериям селективное преимущество — возможность утилизировать олигопептиды, однако, активация оперона ybeJ-gltJKL-ybeK предоставляет другую возможность — более эффективно, чем клетки дикого типа утилизировать мономерные аминокислоты. Таким образом, инактивация одного гена и активация другого приводит к возможности использовать другой источник питания, то есть адаптироваться к другой экологической нише [121].

Этот пример делает очевидным, что инсерция IS5 происходит не потому, что она даёт селективное преимущество. Инверсия IN(cstA::IS5-IS5D) выключает индуцированный ген cstA, который уже обеспечивал селективное преимущество. Однако активация оперона ybeJ-gltJKL-ybeK обеспечивает новое селективное преимущество. Как инсерция, так и инверсия происходят потому, что этому благоприятствует структура генома: между промотором и CRP сайтом гена cstA есть сайт интеграции IS5, а внедрение IS5 обеспечивает возможность рекомбинации между двумя копиями, что в свою очередь, приводит к инверсии. Очевидно, что возникновение нового вполне определённого адаптивного признака становится возможным и ожидаемым, благодаря вполне определённому строению конкретного участка генома и свойствам элемента IS5.

Как патогенным бактериям и простейшим, так и комменсалам, свойственны различные виды антигенной изменчивости [см. 4, 114, 105]. Молекулярные механизмы антигенной изменчивости различны, но все они, так или иначе, связаны с геномными перестройками. Так, например, у возбудителей сонной болезни трипаносом около 20 теломер (из 44) содержат гены VSG (Variant Surface Glycoprotein), которые кодируют поверхностный доминантный антиген. Из 20 возможных сайтов экспрессии работает только один. После укуса мухи це-це в организме позвоночного с частотой около 10-3 на клетку на генерацию происходит смена VSG. Смена обеспечивается за счёт рекомбинации между экспрессирующейся копией гена и одним из многих сотен молчащих гомологичных, но не идентичных аллелей [см. 89]. Очень интересно еще и то что, согласно более поздним данным, молчащая копия гена VSG переносится в сайт экспрессии не сама по себе, а в составе группы (примерно из 6) генов [77, 60]. Одним из генов этой группы является ген рецептора белка трансферина [23]. Этот рецептор обеспечивает способность трипаносом связывать нагруженный ионами железа трансферин теплокровного хозяина. Смена рецептора означает появление способности связывать иной трансферин и, следовательно, выживать, если предыдущий трансферин приносил недостаточно ионов железа. Вся группа генов переносится в сайт экспрессии с частотой максимум 10-3. Таким образом, имеет место реализация некой программы, направленной на появлении в популяции фракции, экспрессирующей рецептор альтернативного трансферина. В том случае, если предыдущий трансферин исчез (смена хозяина) или стал неэффективным, появление нового рецептора позволит фракции, им располагающей, выжить. На мой взгляд, здесь наблюдается реализация програмы преадаптации к возможным изменениям среды обитания, а не фенотипического отбора. Итак, каждая клетка трипаносом содержит около 1000 нееэкспрессирующихся гомологичных генов VSG (и какое-то количество генов рецепторов трансферина), которые не были удалены как ненужные. Они, на самом деле, и не являются ненужными, так как выполняют очень полезную функцию — обеспечивают смену антигенов и рецепоров трансферина для ухода от действия иммунной системы и возможности утилизации ионов железа при смене условий существования. Однако пока ген не экспрессируется он для фенотипического отбора не существует, является «невидимым» для внешней среды. Фенотипический отбор должен опираться на определенный фенотипический признак. Следовательно, фенотипический отбор не мог способствовать закреплению и сохранению многих сотен молчащих гомологичных копий генов VSG в ходе филогенеза трипаносом. В рамках концепции Пн-выбора экспансию генов VSG можно объяснить не тем, что она была для чего-то необходима, а тем, что для неё были соответствующие молекулярные возможности в геноме. Соответственно, сохранение молчащих копий генов в этом и во всех других случаях объясняется отсутствием молекулярных условий для их делетирования. Остаётся непонятным, как осуществляется выбор одной молчащей копии из сотен для перемещения в сайт экспрессии и рекомбинации (последовательность смены антигенов подчиняется некой программе). Также непонятно, чем определяется частота смены VSG , то есть транспозиции, так как при заражении через шприц она равна 10-6 , а при укусе мухи це-це около 10 -3 [102].

Подобные, но не идентичные системы антигенной изменчивости описаны для многих микроорганизмов и одноклеточных простейших. В большинстве случаев механизмы фазовых вариаций и антигенной изменчивости предетерминированы локализацией и видом повторяющихся последовательностей и МГЭ [см.4, 105, 18] Более поздние данные только подтверждают это положение. Так, установлено, что локализация наиболее распространённых в геноме трипаносом повторяющихся последовательностей, — ретропозонов RIME и Ingi, — неслучайна [25]. Также неслучайными оказываются и генетические изменения, за счёт которых меняет свои поверхностные антигены возбудитель болезни Лайма — Borrelia burgdorferi. В плазмиде этой спирохеты находятся одна экспрессирующаяся (vlsЕ) и 15 «молчащих» копий кассет с геном основного поверхностного липопротеина VLS. В генах vls есть 6 консервативных и 6 высоковариабельных областей; последние, вероятно, и определяют разнообразие антигенного репертуара. Как экспрессирующаяся, так и «молчащие» копии vls фланкированы прямыми повторами консервативных 17-членных последовательностей TGAGGGGGCTATTAAGG. После инфекции индуцируется механизм рекомбинационного обмена между экспрессирующейся и «молчащими» копиями vls. 17-членные последовательности, скорее всего, распознаются рекомбиназами, которые осуществляют замещение фрагментов гена vlsЕ на гомологичные, но не идентичные участки ранее не экспрессировавшихся копий vls. Так происходит постоянная смена эпитопов поверхностных антигенов боррелий в организме теплокровного хозяина [118]. Генетический механизм смены антигенов у возбудителя болезни Лайма очень похож на таковой, свойственный возбудителю гонореи, и в этом примере не было бы ничего удивительного, если бы не ограничение генных кассет прямыми повторами 17-членных последовательностей. Всё-таки, обычно, прямые повторы способствуют удалению из генома заключённого между ними участка ДНК. В данном случае справедливо обратное — неэкспрессирующиеся копии генов vls сохраняются в геноме плазмиды, несмотря на то, что они ограничены прямыми повторами.

Следовательно, различные генетические механизмы смены антигенов представляют собой программы геномных перестроек, которые детерминированы полинуклеотидными последовательностями генома микроорганизма. Сказанное, на мой взгляд, соответствует концепции Линн Капорале, которая говорит о том, что геномы эволюционируют в направлении совершенствования способности к эволюции, в направлении готовности к предстоящим переменам условий существования [см. 29, 30].

Ранее говорилось о том, что одним из доминирующих механизмов внедрения участков генетического материала в ДНК-мишень является интеграция в сайты, находящиеся в генах тРНК и тмРНК. Как уже говорилось, гены тРНК имеют три сайта интеграции, два из которых симметричны, а один — нет. Интегразы, связывающиеся с этими сайтами, строго специфичны, т.е. взаимодействуют либо с симметричными, либо с не симметричными сайтами [82, 115]. Следовательно, установлению этой строгой специфичности должна была предшествовать коэволюция генов тРНК и генов интеграз. (Это, в принципе, относится к любой системе ДНК-белкового взаимодействия). Трудно себе представить, что было предметом фенотипического отбора на этапах координированной эволюции генов, кодирующих ферменты, и последовательностей-мишеней этих ферментов. Интересно, что во многих случаях гены интеграз и сайты интеграции сцеплены, что тоже не может быть случайностью [119, 53]. Конечным результатом такой коэволюции является образование координированной системы интеграции (или транспозиции) сегментов ДНК в определённый сайт генома. Данный конечный результат не может быть объектом фенотипического отбора, так как неизвестно, какой именно фенотипический признак привнесёт с собой наследуемый сегмент ДНК и «принесёт» ли он какой-нибудь признак вообще. Предположение, что такая система создавалась «на всякий случай», несостоятельно, так как фенотипический отбор не обладает даром предвидения. Это справедливо и для сохранения в геноме сотен молчащих генов VSG у трипаносом, которые, однако, могут понадобиться, и для других подобных случаев. Единственная возможность сохранить в представлении об эволюции таких двух (и более) компонентных систем роль фенотипического отбора состоит в следующем. Можно предположить, что при первом акте объединения в одном геноме гена, кодирующего интегразу или транспозазу, и нуклеотидной последовательности-мишени, которую этот фермент способен узнать, произошло успешное «срабатывание» новой системы, при котором в сайт-мишень интегрировался фенотипически значимый ген, то есть ген, придавший клетке селективное преимущество. В этом случае за счёт естественного отбора был отобран привнесённый ген. Но так как клон, его содержащий, уже имел новую систему ДНК-белкового взаимодействия, обеспечивающую интеграцию новых сегментов ДНК в новый сайт, то и она могла быть косвенным образом отобрана. Десять лет назад для того, чтобы распространить роль фенотипического отбора на косвенный отбор неселектируемых признаков (на самом деле, цитируемая работа относилась к отбору так называемых эволюционных генов, например, генов-мутаторов) такой отбор был назван отбором второго порядка [110, 16]. Значит, чтобы сохранить за фенотипическим отбором возможную роль в возникновении систем интегративной рекомбинации, нужно предположить, что в каждом из случаев возникновения таких систем одна из первых «сборок» их компонентов сопровождалась транспозицией или интеграцией, привносящими селективное преимущество. Теоретически это, наверное, возможно. Однако об этом мы ничего не знаем.

Пн-выбор представляется более древним механизмом формирования генома, чем классический фенотипический отбор, так как должен был оперировать раньше, чем возникли полноценные клеточные формы жизни и, соответственно, селектируемые фенотипические признаки. Это более универсальный механизм, так как оперирует на нуклеотидных последовательностях независимо от наличия в них рамок считывания (генов).

III.1. Вклад Пн-выбора и фенотипического отбора в приобретение и потерю фенотипически значимых генов.

Рассмотрим роли фенотипического отбора и Пн-выбора при утрате и приобретении фенотипически значимых генов и фрагментов ДНК, не влияющих на фенотип.. Под фенотипической значимостью гена подразумевается возможность селекции кодируемого им признака. В случае приобретения нового гена реципиентным геномом положительный результат (внедрение), независимо от фенотипической значимости привносимой информации, будет зависеть от наличия сайта интеграции для конкретного полинуклеотидного фрагмента (нового гена) и наличия ферментов, обеспечивающих этот тип интеграции. То есть в данном случае необходимым и достаточным является Пн-отбор. Фенотипический естественный отбор может служить только дополнительной гарантией стабильности унаследованного гена, пока существуют условия, в которых продукт гена значим для клетки. К подобному заключению относительно градации ролей Пн-отбора и естественного отбора пришли и другие авторы, работающие с растениями [20]. То есть, фенотипический отбор не является необходимым для наследования и сохранения в геноме генетического материала. Подтверждением этого является повсеместное присутствие в клетках самых разнообразных не кодирующих последовательностей.

Достаточно сказать, что псевдогены и не кодирующие повторы, хотя и в очень незначительном количестве, обнаружены даже в одном из самых маленьких из известных на настоящий момент геноме Nanoarchaeum equitans — единственного паразита среди архей и единственного представителя нового царства наноархей. При этом геном N. equitans не только очень маленький, но и самый компактный (95% ДНК кодирует белки и стабильные РНК), в отличие от геномов бактериальных паразитов и эндосимбионтов, не претерпел редуктивной эволюции, а был сформирован в теперешнем виде изначально. Авторы, правда, полагают, что N. еquitans является, все-таки, производным какой-то более древней археи. (It has a highly compact genome with few pseudogenes or long regions of noncoding DNA. Consequently, we suggest that this microbe is a derived, but genomically stable parasite that diverged anciently from the archaeal lineage). [109].

(Здесь необходимо отметить, что только что была опубликована на данный момент сенсационная статья, в которой показано существование бактериального организма, геном которого значительно меньше, чем геномы всех (трёх) ранее известных «рекордсменов». Это эндосимбионт, живужий в цитрусовых псилидах  — насекомых, питающихся соком растений. Он назван Carsonella ruddii [71]. Геном этой бактерии состоит только из примерно 160 т.н.п. и содержит только 182 белок-кодирующих генов. Это очень близко к рассчитанному на компьютере минимальному размеру генома — 113 т.н.п. Уместно напомнить, что геном человека состоит из 3 миллиардов н.п.)

Геномы, претерпевшие редуктивную эволюцию в значительном объёме, тоже содержат псевдогены. У B. aphidicola str. Bp из Baizongia pistaciae их 10, а это значит, что ненужные гены не были утрачены как не поддерживаемые отбором, а в течение миллионов лет сохранялись в предельно редуцированном геноме.

Наиболее яркие примеры наследования генов, которое трудно объяснить влиянием фенотипического отбора, то есть предоставлением селективного преимущества бактериям, унаследовавшим новый ген, предоставляет горизонтальный перенос.

1). Бактерии B. quintana, содержат горизонтально перенесенный ген yopP, кодирующий антифагоцитарный белок-эффектор иерсиний, и ген секреторного белка для гемолитического токсина азотфиксирующей почвенной бактерии Sinorhizobium meliloti. Ни тот, ни другой ген не могли быть селекционированы фенотипическим отбором, поскольку являются частями сложных генетических систем и сами по себе никакой функции выполнять не могут. Однако оба этих гена сцеплены с генами тРНК и, следовательно, внедрились в сайт интеграции тРНК [9].

2) Ген пролил-тРНК синтетазы M. leprae отличается от других генов тРНК синтетаз этой бактерии. Он происходит не от общего с M.tuberculosis предшественника, а скорее всего был перенесен из генома Borrelia burgdoferi [34].

3). Одноклеточные простейшие, — патогенные для человека парабазилиды Trichomonas vaginalis — получили гены прoлил-тРНК-синтетазы и аланил-тРНК-синтетазы от представителя иного царства (Nanoarchaeota) — N. equitans [14].

4). Ещё один случай перемещения генетического материала между царствами: фрагмент генома бактерии Wolbachia встроился в X-хромосому жука Callosobruchus chinensis [72].

Указанные случаи, однако, легко объясняются на основе концепции Пн-отбора.

При потере гена складывается другая ситуация. Для удаления генетического материала из ДНК также необходим Пн-выбор. В данном случае он выражается в наличии фланкирующих удаляемый ген полинуклеотидных последовательностей, благоприятствующих исключению. Наиболее изученные случаи — это наличие повторяющихся последовательностей, типа IS-элементов, на которых могут оперировать те или иные ферменты рекомбинации. Если гены сохраняются в геноме, это не означает автоматически, что они необходимы для клетки в данных условиях. Это означает, что в геноме нет условий для их утраты.

Так, показано, что потеря генов при редукции геномов происходит в два этапа. Сначала ген инактивируется за счёт мутации, а потом уже инактивированный ген (псевдоген) делетируется [10, 97, 48]. Период полураспада псевдогенов у Buchnera aphidicola составляет 24 миллиона лет. Полная элиминация псевдогена достигается за 40 — 60 миллионов лет [48]. То есть, ненужная ДНК задерживается в геномах на десятки миллионов лет.

Среди патогенных бактерий, геном которых в наибольшей степени «пострадал» от редукции, выделяется M.leprae (Табл. 1). Несмотря на утрату значительной части, редуцированный геном M.leprae сохранил 1 115 псевдогенов — намного больше, чем в геноме любого другого возбудителя и достаточно большое количество некодирующих повторов (Табл. 1, Рис. 7). Как в геноме Y.pestis, находящейся, видимо, в начальной стадии редуктивной эволюции, так и в геноме M.leprae, ушедшей по пути редукции генома дальше других возбудителей инфекций, IS-элементов намного больше, чем у их «не редуцированных» ближайших родственников (см. выше). Сохранение и «размножение» в геномах Y.pestis, B.pertussis, B.mallei, M.leprae, претерпевающих редукцию геномов, фенотипически не значимой ДНК (повторов различного типа, IS-элементов) также свидетельствует против утверждения, что «ненужный» генетический материал, не поддерживаемый отбором, утрачивается.

Рис. 7. Количество псевдогенов в геномах различных бактерий.

 

 

Экспериментальных доказательств того, что удаление из генома нейтральной генетической информации сообщает клеткам селективное преимущество нет или они неизвестны автору. Однако существуют данные о том, что в результате потери генетического материала селективные преимущества не возникают [98].

Если условия Пн-выбора позволяют потерю ДНК за счёт делеции, наследование такой делеции в потомстве будет строго зависеть от того, насколько необходим утраченный признак для клетки в данных условиях существования. То есть, вероятность потери фенотипически не значимых участков генома будет определяться только Пн-выбором. В случае благоприятного для делеции полинуклеотидного окружения данного фенотипически не значимого сегмента ДНК, такой сегмент будет с высокой вероятностью делетирован. Если рассматриваемый сегмент ДНК содержит фенотипически значимую информацию, то гены, кодирующие необходимые на данный момент и в данных условиях признаки, сохранятся в потомстве. Это не значит, что делеций этих генов не происходит. Просто выживают бактерии, не претерпевшие делеций. Примером нестабильности, определяемой контекстом, может служить поведение одного из участков ДНК Y. pestis.

Рис. 8. Pgm локус (102 тнп) Y. pestis KIM10, ограниченный прямыми повторами элемента IS100.

 

В хромосоме иерсиний есть локус рgm (Рис. 8). Если все гены этого локуса полноценны, имеет место пигментация бактерий (Pgm+ -фенотип). Однако этот фенотип нестабилен и с большой частотой утрачивается [28]. Оказалось, что весь сегмент ДНК, размером 102 тнп, делетируется за счёт рекомбинации между прямыми повторами ограничивающих его элементов IS100 [43]. Частота таких делеций в recA+ штаммах достигает значения 10-3 [50]. То есть, такие делеции происходят всё время в каждой тысячной клетке популяции. В отличие от ситуации с псевдогенами B.aphidicola, удаление из геномной ДНК одного из её сегментов не требует не то, что десятков миллионов лет, а происходит постоянно. Следовательно, миллионолетняя задержка удаления псевдогенов имеет место тогда, когда для делеций нет условий. В случае с локусом рgm такие условия есть, — это фланкирующие элементы IS100.

То есть, в случае потери фенотипически значимых генов для осуществления делеции важны условия Пн-выбора, а для сохранения популяции в условиях вероятности делеции, — фенотипический (естественный) отбор. Сделанные выводы суммированы в Табл. 5.

            Таблица 5.  Зависимость приобретения и потери фенотипически значимых генов и нейтральной генетической информации от полинуклеотидного отбора и фенотипического (естественного) отбора.

                            События

 

 Зависимость

от отбора

Приобретение

Потеря

Фенотипически

значимые

 

Нейтральные

Фенотипически

значимые

 

Нейтральные

 

Пн-отбор

 

+

 

+

 

+

 

+

Фенотипический

отбор

 

-

 

-

 

+

 

-

 

Из сказанного следует, что генетический материал наследуется извне или удаляется из генома, если для этого есть возможность, определяемая структурой самого генома. Унаследованный ген стабилен, если геном не предоставляет ему условий для делеции. Роль фенотипического (естественного) отбора в этой системе равна нулю. Это означает, что первичные этапы любых изменений геномов и как следствие — выбор пути эволюции геномов (компактизация или накопление) определяются особенностями структуры самих геномов. Структура геномов формируется благодаря предшествующему Пн-выбору. Фенотипический (естественный) отбор оперирует на следующем этапе и его объектом может быть часть тех изменений генома, которые были разрешены его структурой.

IV. Выбор пути эволюции генома. Гипотеза пульсации генома.

В свете представлений о Пн-выборе редукция геномов может рассматриваться следующим образом. Геномы, структура которых благоприятствует утрате генетического материала, подвергаются редукции и постепенно утрачивают степени свободы своего (своих носителей) существования. Например, у Buchnera aphidicola на определённом этапе эволюции были утрачены все гены, за исключением тех, которые позволяли этим бактериям существовать в организмах растительных тлей. Соответственно, бушнерa остались в тлях. Более того, они утратили ген recA, что ограничило возможности дальнейших перемен в их геномах только событиями незаконной рекомбинации.

Такой путь уготован далеко не всем эндосимбионтам. В частности, бактерии Wolbachia, видимо, не имели такой жесткой программы редукции, как бушнера и, будучи эндосимбионтами-паразитами, остались способными инфицировать самых разнообразных хозяев: муравьёв, жуков, плодовых мушек, пауков (в качестве паразитов) и даже нематод (в качестве симбионтов). Более того, они сохранили способность к рекомбинации и активно её используют, — их геномы участвуют в частых актах межгенных обменов и горизонтального переноса [17, 112, 113, 83].

У каждого вида бактерий существует своя собственная программа развития генома. Так, из почвенной бактерии общего предшественника образовались виды B. mallei — возбудитель сапа, B. pseudomallei — возбудитель мелиоидоза, и B. thailandensis — непатогенный сапрофит, геномы которых, сохраняя родство, существенно отличаются и по набору генов, и по направлению развития.

В том случае, когда эволюция генома идёт по пути редукции среди геномных перестроек преобладают делеции. Делеции — это события, которые могут привести не только к утрате генов. Они приводят к тем же последствиям, что и транслокации и инверсии, то есть к изменению нуклеотидных последовательностей и, следовательно, имеют такой же эволюционный потенциал. Потеря сегментов ДНК при компактизации геномов — это делетирование. Следовательно, компактизация генома, изменяя его нуклеотидные последовательности, может изменить вероятность последующих перестроек, в том числе интеграции сегментов ДНК в сайты, возникшие вследствие делетирования. При этом, нас интересуют случаи увеличения такой вероятности. Коль скоро, на месте делетируемых нуклеотидных последовательностей возникают новые нуклеотидные последовательности, то в случае формирования эффективного сайта интеграции, в этот сайт будут внедряться сегменты ДНК (блочные модули), отличающиеся от делетированных. Тогда компактизация генома сама по себе может не только создавать условия для последующей экспансии, но и обеспечивать поглощение геномом качественно новой информации. Отсюда следует, что программа генетических изменений генома изменяется в ходе осуществления этих изменений и определяется уже произошедшими генетическими перестройками.

Можно предположить, что после достижения минимального размера генома, совместимого с условиями существования, часть популяции вида, может начать новый цикл захвата генетического материала. Этому может способствовать и мутационный процесс. Показано, что редукция геномов приводит к увеличению частоты точковых замен пар оснований ДНК [67, 116, 52], что возможно, в значительной степени связано с утратой редактирующих и других компонентов репаративных систем на ранних стадиях редукции [8, 35]. Высокая частота замен должна увеличить вероятность образования сайтов интеграции вновь привнесённых фрагментов ДНК в геном.

Если такой процесс может иметь место, то пульсация геномов представляется одним из возможных механизмов эволюции.

Гипотеза пульсации геномов в общих терминах и формально противоречит так называемому «закону Долло», который утверждает, что «эволюция прерывиста, необратима и ограниченна» [39], но вполне согласуется со взглядами Соболева, краеугольным камнем теории которого является обратимость процесса эволюции [5]. В рамках концепции пульсации генома фаза редукции представляется следующим образом. В геноме произошло такое распределение горячих точек рекомбинации (IS-элементы, профаги, повторяющиеся последовательности), которое благоприятствует утрате генетического материала. Если возникающие делеции затрагивают гены, необходимые для жизни в окружающей среде, фракция популяции данного обладателя редуцирующегося генома гибнет. Выживает та фракция популяции, которая оказывается в более благоприятных условиях, в которых делетированные гены не требуются. В этих условиях процесс компактизации может продолжаться до тех пор, пока объём и содержание генома будут совместимы с жизнью его обладателя. То есть, компактизация (делеции) начинается не тогда, когда бактерии попали в организм теплокровного, а тогда, когда для компактизации создались условия в геноме. В эукариотическом организме этот процесс будет успешно продолжаться без таких потерь выживаемости, какие могут быть в иных, менее благоприятных условиях.

Совершенно очевидно, что «пульсация геномов» — механизм достаточно медленный даже по геологическим мерам времени и поэтому применимый только для эволюции геномов, скорость размножения носителей которых сравнима с таковой у бактерий.

Если редукция геномов не ведёт в тупик, то в реально существующих редуцированных геномах должны происходить изменения, отличные от редукционных, т.е. от делеций. Такие изменения удается зарегистрировать. Например, среди патогенных бактерий значительной редукции подвергся генов M. leprae. При этом установлено, что пролил-тРНК синтетаза, кодируемая геном proS, в отличие от других тРНК синтетаз, не гомологична одноимённому ферменту M.tuberculosis, а более всего близка с ферментом Borrelia burgdoferi и эукариотов (дрозофилы, человека и дрожжей) (Рис. 9). Предполагается, что M. leprae получила ген proS от B.burgdoferi, которая в свою очередь, унаследовала его от человека. Ген proS расположен в геноме M. leprae в ином месте и инвертирован по сравнению с положением proS в геноме M.tuberculosis [34] (Рис. 9). То есть редукция генома в данном случае не была препятствием для наследования гена за счёт горизонтального переноса.

Рис. 9. Позиции гена proS в хромосомах Micobacterium leprae (верх) и Micobacterium tuberculosis (низ).

 

 

Наряду с M. genitalium обладателем очень маленького бактериального генома является B. aphidicola — эндосимбионт растительных тлей. Сравнивая полные нуклеотидные последовательности геномов двух клонов B. aphidicola Bap и Bsg, выделенных из различных видов афид (Acyrthosiphon pisum и Schizaphis graminum — принадлежат подсемейству Aphidinae, но различным трибам: Macrosiphini, и Aphidini, соответственно), авторы обнаружили, что за огромный срок (десятки миллионов лет) в геномах не произошло никаких изменений: транспозиций, дупликаций или приобретений извне, — найдено лишь несколько потерь. Это состояние бушнера было названо геномным застоем [100].

С учётом данных, полученных с другими штаммами бушнера картину процесса, названного «50-ти миллионолетним геномным застоем» [100] можно кратко суммировать следующим образом. Предшественник B. aphidicola содержал криптическую плазмиду IncFII группы несовместимости c геном repA (Рис. 10). В его хромосоме находился лейциновый оперон. До или после установления симбиотических отношений с афидами лейциновый оперон претерпел транслокацию в плазмидный геном. Образовались лейциновые плазмиды, порядок и количество генов в которых со временем менялись и оказались различными в плазмидах разных штаммов. После этого, вероятно, происходила обратная транслокация лейциновых генов из плазмид в хромосомы некоторых штаммов. Различная локализация leu-генов в хромосомах разных штаммов B. aphidicola связана либо с геномными перестройками хромосом, либо с событиями обратной транслокации из плазмид. Более вероятно, что транслокация в криптическую плазмиду произошла ещё в общем предшественнике бушнера, а затем, возможно, уже после дивергенции афид и, следовательно, после установления симбиотических отношений с бушнера, то есть в ходе их совместной эволюции имели место события обратной транслокации генов в хромосомные сайты.

Рис. 10. Интеграция и эксцизия плазмид Buchnera aphidicola.

 

 

При этом, по меньшей мере в одном из случаев (Buchnera sp. штамм PSY) установлено, что рекомбинация при реинтеграции в хромосому плазмиды, содержащей гены лейцинового оперона, произошла между двумя прямыми повторяющимися последовательностями, одна из которых находится между хромосомными генами rep и trxA, а другая — между плазмидными генами leuD и leuA [94].

Каким-то образом ген ibp сначала попал в две из семи известных плазмид бушнера, а затем он переместился в хромосомы двух (из трёх сиквенированных) геномов бушнера, а в одном из штаммов в сайте его интеграции оказались гены триптофанового оперона. В некоторых штаммах бушнера образовались химерные pTrp/Leu плазмиды, а в некоторых плазмидах к гену repA добавился repA/C [46, 107] (Рис.11).

Рис. 11. Структура плазмид Buchnera aphidicola.

 

 

Перечисленные различия в локализации одних и тех же генов как в хромосомах, так и в плазмидах Buchnera sp могли возникнуть и в досимбиотический, и в постсимбиотический периоды эволюции эндосимбионтов. Однако вряд ли различия (если они существуют) в биохимии организмов тлей, принадлежащих разным семействам, могли определить различную локализацию генов в плазмидах и хромосомах бактерий бушнера. В пользу этого говорит также следующее наблюдение.

Эндосимбионт мухи це-це W. glossinidia и эндосимбионт тлей B. aphidicola призошли от общего с E.coli предшественника. Однако плазмида W. glossinidia pWig1 отличается от плазмид B. aphidicola. Она содержит 6 не родственных генов. Если бы все эти гены были метаболическими, то их присутствие в плазмиде можно было бы объяснить особенностями отбора со стороны хозяина (мухи це-це), а отличия от плазмид бушнер — биохимическими отличиями мухи це-це от растительных тлей. Однако в плазмиде pWig1найдены гены, кодирующие белок теплового шока (WGpWb0006 [ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=full_report&list_uids=3112730 ]), (его кодирует ортолог гена ibp B. aphidicola BAp и B. aphidicola BSg), липопротеин TraT (устойчивость к нормальной сыворотке и поверхностное исключение WGpWb0003 [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=full_report&list_uids=3112725]), белок-механосенсор (ген yggB [ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=full_report&list_uids=3112727 ]) и неизвестный гипотетический белок (WGpWb0004 [ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=full_report&list_uids=3112726 ]) [8]. Видимо, различия генов плазмид у W. glossinidia и B. aphidicola имеют иные причины, нежели различные метаболические потребности мух. Скорее всего, перечисленные гены плазмиды pWig1 сохранились от общего предшественника и не были делетированы, несмотря на невостребованность их продуктов в условиях облигатного эндосимбиотизма.

Поскольку в ряде случаев зарегистрированы генетические различия у бактерий (Buchnera sp. BBp и BPs), живущих в одном и том же подсемействе тлей [95], очевидно то, что после установления симбиотизма происходили не только редуктивные изменения геномов бушнера, но и разнообразные обмены между хромосомой и плазмидой.

В чём причина транслокации генов лейцинового и триптофанового оперонов у предшественника B. aphidicola из хромосомы в плазмиды неизвестно. Сначала предполагалось, что эти события обусловлены селекцией признака суперпродукции лейцина и триптофана, необходимых для жизни афид. Однако оказалось, что хромосома B. aphidicola тоже мультикопийна [57]. Репликаторы плазмид бушнер относятся к классу несовместимости IncFII, и копийность плазмид может быть даже ниже, чем копийность хромосомы [81], что делает предположение о преимуществах плазмидной локализации генов биосинтеза лейцина и триптофана бессмысленным. То есть объяснение закрепления генов в плазмидах за счёт фенотипического отбора некорректно. С точки зрения фенотипического отбора непонятны также, причины обратной транслокации этих генов в хромосомы. Тем более, влиянием фенотипического отбора никак нельзя обьяснить различную хромосомную локализацию генов лейцинового оперона (4 разных сайта внедрения) в хромосомах различных штаммов B. aphidicola. Однако перечисленные факты свидетельствуют о рекомбинационных событиях, отличных от делеций и происходивших в максимально редуцированных геномах.

В дополнение к этим данным, получено одно очень важное свидетельство горизонтального постсимбиотического переноса генетического материала у B. aphidicola [108]. Было установлено, что ген repA1 из плазмиды pBPs1 B.aphidicola, выделенной из тлей Pemphigus spyrothecae, существенно отличается от всех известных repA1 последовательностей бушнера. На основе филогенетического анализа был сделан вывод о том, что ген repA1 попал в плазмиду за счёт горизонтального переноса. Поскольку этот вывод чрезвычайно важен и относится к единственному достоверному случаю постсимбиотического приобретения генетического материала бушнерами, авторы приводят определённые доказательства помимо традиционного филогенетического анализа. Так, плазмида pBPs1, в которой находится уникальный ген repA1, содержит ген ibp, происходящий из хромосомы и полностью филогенетически соответствующий Buchnera. Таким образом, плазмида pBPs1 является рекомбинантной и содержащей ген ibp хромосомного происхождения и горизонтально перенесённый ген repA1 неизвестного происхождения. У B. aphidicola, выделенной из P. spyrothecae, найдены триптофановые плазмиды, которые по свойствам репликона несколько отличаются от других плазмид B. aphidicola [107], но гены trp оперона, как и ген ibp плазмиды pBPs1, происходят из хромосомы Buchnera.

Источник гена repA1 B.aphidicola, выделенной из P. spyrothecae, остаётся неизвестным, но им могли быть вторичные эндосимбионты или свободноживущие бактерии. Итак, в организме, геном которого находится почти в низшей точке редукции, могут происходить как генетические перестройки, так и приобретение генов извне.

Коль скоро, ген recA в сиквенированных геномах B. aphidicola делетирован, объём рекомбинационных событий в этих геномах ограничен возможностями recA-независимой рекомбинации. То есть мы располагаем свидетельствами рекомбинационной активности генома B. aphidicola, количество которых занижено в результате потери гена recA. Это означает, что в рекомбинационно профицитных редуцированных геномах приобретение генетического материала тем более может иметь место. Последнее подтверждается особенностями генетического поведения бактерий Wolbachia. Эти бактерии взаимодействуют с инфицируемыми ими объектами в очень широких рамках отношений: от симбиотического мутуализма до строгого паразитизма. Геном различных изолятов бактерий Wolbachia содержит от 800 до 1200 генов, кодирующих белки, то есть на 300 — 700 генов больше, чем бактерии B. aphidicola. Будучи эндосимбионтами (паразитами), они сохранили способность к рекомбинационному обмену, включая горизонтальный перенос, и соответственно, к разнообразным геномным перестройкам [17, 112, 83].

Приведенные данные говорят о возможности дальнейших эволюционных преобразований редуцированных геномов, то есть являются веским аргументом в пользу гипотезы «пульсации» геномов.

V. Заключение

Редукции подвержены не только геномы микроорганизмов-паразитов — возбудителей опасных инфекционных болезней и эндосимбионтов, но и геномы свободноживущих непатогенных бактерий, поэтому паразитизм или эндосимбиотизм не могут считаться единственной и главной причиной редуктивной эволюции.

Как удаление из ДНК сегментов генома, так и внедрение в геномы генетического материала за счёт горизонтального переноса определяется в первую очередь наличием или отсутствием молекулярных условий для осуществления этих событий. Реализация этих условий в данной работе названа полинуклеотидным (Пн)-выбором. Компонентами Пн-выбора являются:

1. наследуемый (или удаляемый из генома) полинуклеотидный фрагмент,

2. полинуклеотидная последовательность-мишень или сайт интеграции (делеции),

3. фермент(ы), осуществляющий (ие) рекомбинационный акт.

Выбор нового сегмента ДНК под влиянием свойств ДНК-мишени принципиально отличается от классического фенотипического отбора тем, что объектом его действия является не фенотипический признак, а последовательность нуклеотидов. Пн-выбор — это отбор полинуклеотидов под влиянием полинуклеотидного контекста.

Наиболее вероятная последовательность эволюционно важных событий в геномах, приводящая к возможности приобретения генетического материала извне или его удаления из генома, представляется следующим образом. Сначала за счёт ошибок репликации (slipped strand mispairing) возникают близко расположенные короткие тандемные повторы, которые могут дуплицироваться и за счёт геномных перестроек распространяются по геному. Уже эти повторы могут генерировать делеции. Повторы могут служить сайтами интеграции для IS-элементов. IS-элементы и другие МГЭ также являются горячими точками для рекомбинаций, приводящих к делециям (прямая ориентация) или другим геномным перестройкам: инсерциям и инверсиям (инвертированные повторы). Инвертированные повторы составляют основу специализированных сайтов интеграции в составе интегронов и генов тРНК, куда внедряются генные кассеты и геномные острова из других геномов. Все перечисленные генетические элементы распределены в геномах неслучайно и в той или иной степени видоспецифично. Соответственно неслучайными и видоспецифичными являются геномные перестройки, стимулируемые повторами и различными МГЭ. Таким образом, структура генома направляет его эволюционное развитие.

Утрата генетического материала запрограммирована особенностями строения геномов, а не определена особенностями внешней среды, в которой находится носитель генома. Носитель генома находится в тех или иных условиях, потому что они соответствуют его возможностям, сформировавшимся после акта редукции.

Большинство актов внедрения в геном фрагментов генетического материала (из другого генома или из другого сайта этого же генома), независимо от наличия или отсутствия в привносимом материале фенотипически значимого гена(ов), происходит в строгой зависимости от реципиентной нуклеотидной последовательности. Унаследованный ген стабилен, если геном не предоставляет ему условий для делеции. Роль фенотипического (естественного) отбора в этой системе равна нулю. Это означает, что первичные этапы любых изменений геномов и как следствие — выбор пути эволюции геномов (компактизация или накопление) определяются особенностями структуры самих геномов. Структура геномов формируется благодаря предшествующему Пн-выбору. Пн-выбор — естественный процесс, который является этапом, предшествующим классическому дарвиновскому отбору. В этой связи естественный отбор представляется процессом, состоящим из двух этапов: 1) полинуклеотидного выбора и 2) фенотипического (дарвиновского) отбора.

Фенотипический отбор оперирует на следующем этапе и его объектом может быть часть тех изменений генома, которые были разрешены его структурой.

В частности выживаемость организма, претерпевшего делецию, всецело зависит от условий внешней среды, в которых оказался данный организм. Организм, в геноме которого произшла делеция жизненно важного для условий свободного существования генетического материала, выживет, если утраченный признак будет комплементирован за счёт хозяина в условиях паразитизма или симбиотизма.

Выдвигается гипотеза, согласно которой редукция геномов не исключает последующей фазы приобретения нового генетического материала («пульсация» геномов)

Представленные данные и их анализ показывают, что структура генома определяет вероятность и характер его перестроек, включая наследование горизонтально перенесённых генов, т.е. определяет вероятность появления новых вариантов генома. Отсюда, при каждом акте репликации геномной ДНК и делении клетки происходит наследование не только существующего генома, но и наследование вероятности появления пока ещё не существующих вариантов. При этом спектр, качество и вероятность таких новых реальностей изменяются в различной степени при каждом акте геномной перестройки.

Благодарность. За интерес, проявленный к работе, поддержку и комментарии автор признателен В.Ю. Литвину, Э.И. Коренбергу, А.А. Прозорову, Е.Д. Свердлову, Линн Капорале, А.С. Саенко и В.А. Ланцову.

Работа была выполнена при частичной финансовой поддержке ВТЕР/ISTC (грант 53/2223).


Mechanisms of acquisition and loss of genetic information by bacterial genomes

G.B. Smirnov

The Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology RAMS, 123098 Moscow, Russia

Summary

Acquisition and deletions of microbial genomes sequences appeared to be important events in genome evolution. The balance between these processes is not always kept. As a result expansion of one genomes and reduction of others occur. Until recently the parasitic or symbiotic style of living was thought to be the prerequisite of genome reduction. Now it is obvious that the reduction of genomes took place not only in the genomes of pathogens and endosymbionts but in free living nonpathogenic microorganisms as well.

Natural selection is a doubtful reason for compactization of microbial genomes since the bacteria of closely related species living under the same or very similar selective conditions do not liable to genome reduction. Instead the acquisition of genetic material occurs in some cases. Thus parasitic and endosymbiotic styles of living could not be considered as a sole reasons for genome reduction.

The concept is putting forward, according to which the acquisition of a novel DNA sequences depends upon the polynucleotide sequence of the target site in the recipient genome. It means that the subject of selection is not the phenotypic trait encoded by the donor DNA but rather the novel DNA sequence irrespective of its coding ability. This kind of selection is designated as polynucleotide (PN)-choice. PN-choice is ample for the acquisition of a novel DNA sequences. In contrast the loss of DNA-sequences requires both PN-choice and Darwinian phenotypic selection.

It is hypothesized that the genome reduction is a phase of bi-directional process — genome «pulsation», i.e. after genome compactization the acquisition of genetic material may occur, leading to the creation of the novel genetic compositions. The genome «pulsation» as an evolutionary mechanism may be feasible only for extensively multiplying genomes.


ЛИТЕРАТУРА

1 Берг Л.С. // Труды по теории эволюции. Л. Наука, 1977.

2 Берг Л.С. // Номогенез, или эволюция на основе закономерностей. Тр. географ. ин-та, Гос. изд.-во Петроград 1, 1922.

3 Любищев А.А. // Проблемы формы систематики и эволюции организмов. Москва. Наука, 1982.

4 Смирнов Г.Б. // ВНИИМИ, Медицина и здравоохранение, сер. Эпидемиология, вирусология и инфекционные заболевания, Выпуск 3. Москва, 1988, с.1.

5 Соболев Д.Н. // Начала исторической биогенетики. Киев. Гос.издат. Украины, 1924.

6 Филипченко Ю.А. // Эволюционная идея в биологии. Москва, Наука, 1977, с.205.

7 Achaz G., Rocha E. P. C., Netter P., and Coissac E.//Nucleic Acids Research, 2002, V. 30, P. 2987.

8 Akman L.A., Yamashita H., Watanabe K., Oshima T., Shiba M., and Aksoy S. // Nat. Genet. 2002, V. 32, P. 402.

9 Alsmark C.M., Frank A.C., Karlberg E.O., Legault B.A., Ardel D.H. Canback l, B., Eriksson A.S., Naslund A.K. , Handley S.A., Huvet M., La Scola B., Holmberg M., and Andersson S.G. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 V. 101(26), P. 9716.

10 Andersson J.O. and Andersson S. G. // Mol. Biol. Evol. 1999, V. 16, P.1178.

11 Andersson J.O. and Andersson S.G.E. // Mol. Biol. Evol. 2001, V.18, P. 829.

12 Andersson S.G.E. and Kurland C.G. // APMIS 1998, Suppl. 84, P.5.

13 Andersson, J.O. and Andersson, S.G. E. // Curr. Op. Gen. Dev.1999, V. 9, P. 664.

14 Andersson, J.O., Sarchfield S.W., and Roger A.J. // Molecular Biology and Evolution 2005, V. 22, №1, P. 85.

15 Aras R.A., Kang J., Tschumi A I., Harasaki Y., and Blaser M.J. // Proc Natl Acad Sci USA 2003, V. 100, P.13579.

16 Arber W. //Ann N Y Acad Sci. 1999, V. 18, № 870, P. 36.

17 Baldo L., Bordenstein S., Wernegreen J.J., and Werren J.H. // Molecular Biology and Evolution 2006, V. 23, №2, P. 437.

18 Barbour A.G. and Restrepo B.I. // Emerging Infectious Diseases 2000, V. 6, P. 5.

19 Barke A and Manning P.A. // Microbiology 1997, V. 143, P. 1805.

20 Bennetzen J., Ma J., and Devos K.M. // Annals of Botany 2005, V. 95, P.127.

21 Berg O.G. and Kurland C.G. // Molecular Biology and Evolution 2002, V. 19, P. 2265.

22 Bi X. and Liu L.F. // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol.1996, V. 54, P. 253.

23 Bitter W., Gerrits H., Kieft R., and Borst P. // Nature 1998, V. 391, P. 499.

24 Bozeman F.M., Masiello S.A., Williams M.S., Elisberg B.L. // Nature 1975, V. 255, P. 545.

25 Bringaud F., Biteau N., Zuiderwijk E., Berriman M., El-Sayed N.M., Ghedin E., Melville S.E., Hall N., and Baltz T. // Mol. Biol. Evol. 2004, V. 21, №3, P. 520.

26 Brinig M.M., Cummings C.A., Sanden G.N., Stefanelli P., Lawrence A., and Relman D.A. // J. Bacteriol. 2006, V. 188, P. 2375.

27 Brockmeier S.L., Register K.B., Magyar T., Lax A.J., Pullinger G.D., Kunkle R.A. // Infect Immun 2002, V. 70, P. 481.

28 Brubaker R.R. // J. Bacteriol. 1969, V. 98, P. 1404.

29 Caporale L.H. // Evolution of Efficient strategies for evolution: Chance Favors the Prepared Genome. Presented at NECSI's second International Conference on Complexity Studies Nashua, New Hampshire, 1998.

30 Caporale L.H. // Annual Review of Microbiology. 2003, V. 57, P. 467.

31 Chain P.S.G., Carniel E., Larimer F. W. , Lamerdin J., Stoutland P. O., Regala W.M., Georgescu A.M., Vergez L. M., Land M. L., Motin V. L. , Brubaker R. R., Fowler J., Hinnebusch J., Marceau M., Medigue C., Simonet M., Chenal-Francisque V., B. Souza , Dacheux D., Elliott J.M., Derbise A., Hauser L.J., and Garcia E. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004,V. 101, №38, P. 13826.

32 Chedin F., Dervyn E., Dervyn R., Ehrlich S.D., and Noirot P. // Mol. Microbiol. 1994, V. 12, P. 561.

33 Clark M.A., Baumann L., Thao M.L., Moran N.A., and Baumann P. // J. Bacteriol. 2001, V. 183, P. 1853.

34 Cole S.T., Eiglmeier K., Parkhill J., James K.D., Thomson N.R., Wheeler P.R., Honore N., Garnier T., Churcher C., Harris D., Mungall K., Basham D., Brown D., Chillingworth T., Connor R., Davies R.M., Devlin K., Duthoy S., Feltwell T., Fraser A., Hamlin N., Holroyd S., Hornsby T., Jagels K., Lacroix C., Maclean J., Moule S., Murphy L., Oliver K., Quail M.A., Rajandream M.A., Rutherford K.M., Rutter S., Seeger K., Simon S., Simmonds M., Skelton J., Squares R., Squares S., Stevens K., Taylor K., Whitehead S., Woodward J.R., Barrell B.G. // Nature 2001, V.409, P. 1007.

35 Dale C., Wang B., Moran N., and Ochman H. // Mol. Biol. Evol., 2003, V. 20, №8, P.1188.

36 Dawkins R. // The Selfish Gene. New York and Oxford: Oxford University Press.1976, P. 47.

37 DeShazer D. // J. Bacteriol. 2004, V. 186, №12, P. 3938.

38 Diavatopoulos D.A., Cummings C. A., Schouls L. M., Brinig M.M., Relman D.A., Mooi F. R. // PLOS Pathogens 2005, V.1, P. 4.

39 Dollo L. // Bull. Soc. Belg. Geol. 1893, P. 7.

40 Doolittle W.F. and Sapienza C. // Nature 1980, V. 284, P. 601.

41 Dufresne A., Garczarek L., and Partensky F. // Genome Biology 2005, V. 6, №2, R14.

42 Dufresne A., Salanoubat M., Partensky F., Artiguenave F., Axmann I.M.B.V., Duprat S., Galperin M.Y., Koonin E.V., Le Gall F. // Proc Natl Acad Sci USA 2003, V. 100, P.10020.

43 Fetherson J.D., Schuetze P., and Perry R.D. // Molec. Microbiol. 1992, V. 6, P. 2693.

44 Fuchslocher B., Millar L.L., and Cotter P.A. // Infect Immun. 2003, V. 71, №6, P. 3043.

45 Gil R., Sabater-Muñoz B., Latorre A., Silva F.J., and Moya A. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2002, V. 99, №7, P. 4454.

46 Gil R., Sabater-Munoz B., . Perez-Brocal V, Silva F.J., and Latorre A. // Gene 2006, V. 370, P. 17.

47 Goldshmidt R. // The material basis of evolution (Introd. St.J. Gould). Yale Univ. (1982). (Originally publ.: New Haven:Yale Univ. Press. 1940).

48 Gómez-Valero L., Latorre A., Silva F.J. // Mol. Biol. Evol.2004, V. 21, P. 2172.

49 Gregory T.R. // Gene 2004, V.324, P.15.

50 Hare J.M. and McDonough K.A. // J. Bacteriol. 1999, V. 181, № 16б, P. 4896.

51 Hess W.R. // Curr Opin Biotechnol 2004, V. 15, P. 191.

52 Itoh T., Martin W., and Nei M. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2002 V. 99, P. 12944.

53 Julien B. // J Bacteriol. 2003, V. 185, №21, P. 6325.

54 Keeling P.J. and Fast N.M. // Annu. Rev. Microbiol. 2002, V. 56, P. 93.

55 Kim H S., Schell M.A., Yu Y., Ulrich R.L., Sarria S.H., Nierman W.C., and DeShazer D. // BMC Genomics 2005, V. 6, P. 174.

56 Knight C.A., Molinari N.A., and Petrov D.A. // Annals of Botany 2005, V.95 №1, P.177.

57 Komaki K., and Ishikawa H. // J. Mol. Evol. 1999, V. 48, P. 717.

58 Kroger M.and Hobom G. // Nature 1982, V. 297, P.159.

59 Lesic B. and Carniel E. // Journal of Bacteriology, 2005, V. 187, P. 3352.

60 Lips S., Revelard P., and Pays E. // Mol. Biochem. Parasitol. 1993, V. 62, P. 135.

61 Lovett S.T., Gluckman J., Simon P.J., Sutera V.J., and Drapkin P.T.// Mol. Gen. Genet. 1994, V. 245, P. 294.

62 Mahillon J. and Chandler M. // Microbiology and Molecular Biology Reviews 1998, V. 62, №3, P. 3725.

63 McGrath L.C. and Katz L.A. // Trends in Ecology & Evolution, 2004, V. 19, P. 32.

64 Melano R., Petroni A., Garutti A.,. Saka A.H., Mange L., Pasteran F., Rapoport M., RossiA., and Galas M. // Antimicrob. Agents Chemother. 2002, V. 46, P. 2162.

65 Mira A., Ochman H., and Moran N.A. // Trends in Genetics 2001, V. 17, P. 589.

66 Mira A., Klasson L., and Andersson S.G. // Curr Opin Microbiol. 2002, V. 5, № 5, P. 506.

67 Moran N.A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, V. 93, P. 2873.

68 Moran N.A. // Cell 2002, V. 108, P.583.

69 Moran N.A. and Mira A. // Genome Biology 2001, V. 2, P. 12.

70 Moran N.A. and Wernegreen J. J. // Trends in Ecology and Evolution 2000, V. 15, P. 321.

71 Nakabachi A., Yamashita A., Toh H., Ishikawa H., Dunbar H.E., Moran N.A., Hattori M. // Science 2006, V. 314, №5797, P. 267.

72 Natsuko K., Nikoh N., Ijichi N., Shimada M., and Fukatsu T. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2002, V. 99, P. 14280.

73 Nierman W.C., DeShazer D., Kim H.S., Tettelin H., Nelson K.E., Feldblyum T., Ulrich R.L., Ronning C.M., Brinkac L.M., Daugherty S.C. // Proc Natl Acad Sci USA. 2004, V.101, P.14246.

74 Ogawa A. and Takeda T. // Microbiol. Immunol.1993, V. 37, P. 607.

75 Orgel L.E. and Crick F.H.C. // Nature 1980, V. 284, P. 604.

76 Parkhill J., Sebaihia M., Preston A., Murphy L.D., Thomson N., Harris D.E. // Nat. Genet. 2003, V. 35, P. 32.

77 Pays E., Tebabi P., Pays A., Coquelet H., Revelard P., and Salmon D. // Cell 1989, V. 57, P. 835.

78 Peeters B.P., de Boer J.H., Bron S., and Venema G. // Mol. Gen. Genet 1988, V. 212, P. 450.

79 Petrov D.A. // Theoretical Population Biology 2002, V. 61, P. 531.

80 Petrov D.A., Lozovskaya E.R., and Hartl D.L. // Nature 1996, V. 384, P. 346.

81 Plague G. R., Dale C., and Moran N.A. // Mol. Ecol. 2003, V. 12, P. 1095.

82 Reiter W.D., Palm P., and Yeats S. // Nucleic Acids Res. 1989, V. 17, №5, P. 1907.

83 Reuter M. and Keller L. // Mol. Biol. Evol. 2003, V. 20, №5, P. 748.

84 Rio R.V.M., LefevreC., Heddi A., and Aksoy S. // Appl. Envir. Microbiol., 2003, V. 69, №11, P. 6825.

85 Rocap G., Larimer F.W., Lamerdin J., Malfatti S., Chain P., Ahlgren N.A., Arellano A., Coleman M., Hauser L., Hess W.R. // Nature 2003, V. 424, P. 1042.

86 Rocha E.P.C. and Blanchard A. // Nucleic Acids Research. 2002, V. 30, P. 2031.

87 Romero D. and Palacios R. // Annu. Rev. Genet. 1997, V. 31, P. 91.

88 Rosas-Magallanes V., P. Deschavanne, L. Quintana-Murci, R. Brosch, B. Gicquel, and O. Neyrolles // Molecular Biology and Evolution 2006, V. 23, №6, P.1129.

89 Roth J.R., Benson N., Galitski T., Haack K., Lawrence J. G. // in Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, edited by R. C. H. Neinhardt, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, B. Low, B. Magasanik et al. ASM Press, Washington, DC. 1996, P. 2256.

90 Rowe-Magnus D.A., Guerout A.-M., and Mazel D. // Mol. Microbiol. 2002, V. 43, P. 1657.

91 Rowe-Magnus D.A., Guerout A.-M., Ploncard P., Dychinco B., Davies J., and Mazel D. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, V. 98, P. 652.

92 Rowe-Magnus D.A., Guerout A-M., Biskri L., Bouige P., and Mazel D. // Genome Research 2003, V. 13, P. 428.

93 Rowe-Magnus D.A., Davies J., and Mazel D. // Curr. Top Microbiol. Immunol. 2002, V. 264, P.167.

94 Sabater-Muñoz B., Gómez-Valero L., van Ham R.C.H.J., Silva F.J., and Latorre A. // Applied and Environmental Microbiology, 2002, V. 68, P. 2572.

95 Sabater-Muñoz B., van Ham R. C. H. J., Moya A., Silva F.J., and Latorre A. // Journal of Bacteriology 2004, V. 186, P. 2646.

96 Schultz J.E. and Matin A. // J. Mol. Biol. 1991, V. 218, P. 129.

97 Silva F.J., Latorre A., and Moya A.S. // Trends Genet. 2001, V.11, P. 615.

98 Silwa P. and Korona R. // Proc Natl Acad Sci USA 2005, V. 102, P.17670.

99 Smith G.R. // Microbiol. Rev.1988, V. 52, P.1.

100 Tamas I., Klasson L., Canback B., Naslund A.K., Eriksson A.S., Wernegreen J.J., Sandstrom J.P., Moran N.A., Andersson S.G. // Science 2002, V. 296, №5577, P. 2376.

101 Tobes R. and Pareja E. // BMC Genomics 2006, V. 7, P. 62.

102 Turner C.M. // FEMS Microbiol Lett. 1997, V.153, №1, P. 227.

103 Vaisvila R., Morgan R.D., Posfai J., and Raleigh E.A. // Mol. Microbiol. 2001, V. 42, P. 587.

104 van Belkum A., Scherer S., van Alphen L., and Verbrugh H. // Microbiol Mol Biol Rev 1998, V. 62, № 2, P. 275.

105 van der Woude M.W. and Bäumler A. J. // Clinical Microbiology Reviews 2004, V. 17, P. 581.

106 van Dongen W.M.A.M., van Vlerken M.M.A, and De Graaf F.K. // Mol. Gen. (Life Sci. Adv.)1987, V. 6, P. 85.

107 van Ham R.C.H.J., Martínez-Torres D., Moya A., and Latorre A. // Applied and Environmental Microbiology, 1999, V. 65, P. 117.

108 van Ham R.C.H.J., González-Candelas F., Silva F.J., Sabater B., Moya A., and Latorre A. // Proc. Natl.Acad. Sci. U S A. 2000, V. 97, P. 10855.

109 Waters E.,M.J., Hohn I., Ahel D.E., Graham M.D., Adams M., Barnstead K.Y., Beeson L., Bibbs R., Bolanos M., Keller K., Kretz X.Y., Lin E., Mathur J.W., Ni M., Podar T., Richardson G.G., Sutton M., Simon D., Soll K.O., Stetter J. M., Short M.,

110 Weber M. // Biology and Philosophy 1996, V. 11, P. 67.

111 Wernegreen J.J., Degnan P.H., Lazarus A.B., Palacios C., and Bordenstein S. R. // Biol. Bull. 2003, V.204, P. 221.

112 Werren J.H. and Bartos J.D. // Curr. Biol. 2001, V. 11, №6, P. 431.

113 Werren J.H., Zhang W., and Guo L.R. // Proc. Biol. Sci. 1995, V. 261, № 1360, P. 55.

114 Wildschutte H., Wolfe D. M., Tamewitz A., and Lawrence J.G. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2004, V. 101, №29, P.10644.

115 Williams K.P. // Nucleic Acids Res. 2002, V. 30, №4, P. 866.

116 Woolfit M. and Bromham L. // Mol. Biol. Evol. 2003, V. 20, №9, P. 1545.

117 Wren B.W. // Nature Genetics 2002, V. 32, P. 335.

118 Zhang J.R., Hardham J. M., Barbour A.G., and Norris S.J. // Сell 1997, V. 89, № 2 , P. 275.

119 Zhao S. and Williams K. P. // J. Bacteriol. 2002, V. 184, №3, P. 859.

120 Zinser E.R. and Kolter R. // J. Bacteriol. 1999, V. 181, P. 5800.

121 Zinser E.R., Schneider D., Blot M., and Kolter R. // Genetics 2003, V. 164, P. 1271.

 

Заполните заявку http://kalimiros.com.ua/ горящие туры и путевки с большими скидками!

Hosted by uCoz